Eine einfache Methode für die automatisierte Festphasenextraktion von Wasserproben für die immunologische Analyse von kleinen Schadstoffe
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
Eine neue Methode zur Festphasenextraktion (SPE) des Umweltwasserproben vorgeschlagen. Der entwickelte Prototyp ist kostengünstig und benutzerfreundlich und ermöglicht eine schnelle, automatisierte und einfache SPE durchzuführen. Die vorkonzentrierte Lösung ist mit der Analyse durch Immunoassay kompatibel ist, mit einem niedrigen Gehalt an organischem Lösungsmittel. Es wird ein Verfahren zur Extraktion und Vorkonzentrierung natürliche Hormon 17β-Östradiol in 100 ml Wasserproben beschrieben. Umkehrphasen-SPE mit Octadecyl-Silica Sorbens durchgeführt, und die Elution wird mit 200 ul Methanol 50% v / v durchgeführt. Elutionsmittel wird durch Zugabe von VE-Wasser, die Menge an Methanol senken verdünnt. Nach der Vorbereitung der Säule manuell SPE wird das gesamte Verfahren automatisch innerhalb von 1 h durchgeführt. Am Ende des Prozesses wird Estradiol-Konzentration durch Verwendung eines handelsüblichen Enzym-gekoppelten Immunsorbens-Test (ELISA) gemessen. 100fach Vorkonzentration erreicht wird und der Methanolgehalt in 10% v / v. Vollständige Wiederherstellungen des Molekülswerden mit 1 ng erreicht / L versetzt entionisiertem und synthetischem Meerwasserproben.
Introduction
Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in jedem Analyseprozess. Insbesondere die Entfernung von Matrixeffekten, Verminderung von Interferenzen, und die Anreicherung des Analyten erforderlich sind, um präzise Ergebnisse zu erhalten, und zu erreichen geringe Nachweisgrenzen. Endokrin wirksamen Substanzen (EDCs) sind von besonderer Bedeutung wegen ihrer Wirkung auf die lebenden Organismen, auch wenn in sehr geringen Konzentrationen in der Umwelt. Das natürliche Hormon 17β-Estradiol ist auf dem EU-Wasserverschmutzung Merkliste vorhanden und neigen zu der Liste der im Rahmen der Europäischen Wasserrahmenrichtlinie geregelt prioritären Stoffe aufgenommen werden. Festphasenextraktion (SPE) wird üblicherweise für die Analyse von kleinen Verunreinigungen in Wasser aufgebracht, wobei sowohl chemische 1-5 (Chromatographie, Massenspektrometrie) und immunologischen Nachweisverfahren 6-9. Letzteres gesammelt Interesse auf dem Gebiet der Umweltüberwachung, wie Immunoassays, sind in großen Vielzahl von Formaten, sind spezifisch für die target Analyten und erreicht niedrige Nachweisgrenze. 6 sind 7, 10, 11 verschiedenen Enzymimmuntests (ELISA) im Handel erhältlich und ermöglichen es, mehrere Proben gleichzeitig auf einem Multi-Well-Platte zu analysieren. Das Verfahren besteht in aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte, die ein paar Stunden dauern kann. Das Endprodukt der Reaktion kann optisch detektiert werden, um die Konzentration des Zielmoleküls auf der Basis einer Kalibrierungskurve zu bestimmen.
SPE klassischen Verfahren umfassen Sorbens Vorkonditionierung, Probenextraktion, Waschen, Elution und Eindampfen des Eluats. Die zur Verdünnung des Extraktes verwendeten Lösungsmittels wird so gewählt, je nach dem Nachweisverfahren. Für immunologische Verfahren, die Menge des organischen Lösungsmittels beeinflusst stark die Empfindlichkeit des Verfahrens. 12
Neben der Rückgewinnung und der Pre-Konzentration Performances, muss das Verfahren auch einfach zu sein und kosteneffizient. Automation des procedure hilft, menschliche bezogene Fehler zu verringern. In unserer bisherigen Arbeit 13 stellten wir unsere Prototypen für die automatisierte SPE, und unsere Methode wurde auf die Analyse von dem natürlichen Hormon 17β-Östradiol in Meerwasserproben angewendet. Mit der vorliegenden Video möchten wir die technischen Vorteile unserer Methode im Vergleich zu traditionellen Offline-und Online-SPE und seiner besonderen Kompatibilität mit Nachweis durch Immunreaktionen hervorheben. Wir beschreiben die Wasserproben zum Nachweis von 17β-Estradiol verwendete Protokoll. SPE mit Octadecyl-Silica (C18) Sorptionsphase und die Elution wird mit verdünntem Methanol durchgeführt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein neues Verfahren zur Herstellung von Wasserproben, gefolgt von Analyse unter Verwendung von Immunoassay vorgeschlagen. Das Gerät ermöglicht es, Festphasenextraktion automatisiert und benutzerfreundliche Art und Weise durchzuführen.
Die Filtration der Wasserprobe vor der Injektion in das System ist kritisch. Etwaige Partikel noch in der Lösung vorhanden wäre möglicherweise verursachen Verstopfung des fluidischen Netzwerk und behindern die SPE-Säule. Ein weiterer wichtiger Schritt is…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
References
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