Effektiv pattedyrscelleekspression og Single-trins Oprensning af ekstracellulært glycoproteiner til krystallisation
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Forståelse proteinstruktur på atomart niveau er nøglen til at afdække den molekylære basis for biologiske veje og sygdomme. X-ray proteinkrystallografi er den mest udbredte / anvendelig fremgangsmåde til bestemmelse af makromolekylære strukturer. Den største udfordring ved denne metode er at få tilstrækkelige mængder af korrekt foldet, rene protein. Dette bliver et problem især når der arbejdes med udskilte pattedyrproteiner, der undergår specifikke post-translationelle modifikationer.
Bakterielt udtrykte proteiner er den primære kilde til krystalliserede proteiner deponeret i Protein Data Bank 1. Bakterielle ekspressionssystemer er i høj grad foretrækkes, fordi de er hurtige, billige og typisk producere høje udbytter af protein. Men ekstracellulære domæner af pattedyrsproteiner udtrykt i bakterier er ofte ikke korrekt foldet, hvor der kræves tilfælde refoldnings- og omfattende oprensningstrin til opnåelse af homogent folded protein. Derudover er der mange pattedyrproteiner kræver posttranslationel glycosylering at opnå korrekt foldning 2. Selv om ekspression og glycosylering i gær- eller insektceller kan overvinde foldningen problem, adskiller posttranslationelle modifikationer, herunder glycosylering, væsentligt fra dem for pattedyrceller 3, hvilket gav proteiner med forkerte eller ikke-homogene modifikationer.
Mammale celler udtrykker alle de krævede molekylære maskineri for at sikre korrekte post-translationelle modifikationer og folde; imidlertid er disse ekspressionssystemer ikke typisk foretrækkes af de fleste laboratorier, på grund af begrænsede udbytter og høje omkostninger af reagenser og hjælpematerialer. Polyethylenimin (PEI), en standard transfektionsreagens er relativt billigt, men pålægger betydelig cytotoksicitet og lav transfektion effektivitet, hvilket resulterer i øgede omkostninger i celle medier, DNA og dyrkning udstyr. Mange alternativer til PEI er uoverkommeligt dyre. Vi fatdisse spørgsmål ved at beskrive en kombination af forbedrede cellekultur værktøjer og kemisk modificerede PEI for hurtig og relativt billig fremgangsmåde til ekspression af secernerede proteiner fra pattedyr, efterfulgt af et enkelt trin oprensning. Denne robuste metode giver tilstrækkelige udbytter for funktionelle og biokemiske studier 4, og i nogle tilfælde resulterer i protein modtagelig for krystallisation uden yderligere oprensning.
Denne protokol beskriver adskillige teknikker til at maksimere ekspression og udbytte for secernerede pattedyrprotein i humane embryonale nyre (HEK) 293F celler dyrket i suspension. Transfektion effektivitet (og omkostninger), protein produktion og rensning er alle stærkt forbedret ved at følge denne protokol. PEI modificeret ved tilsætning af carbamater gennem et enkelt trin ringåbnende reaktion (PEI-TMC-25, syntese og egenskaber er beskrevet i detaljer i ref 5) i høj grad forbedrer transfektionseffektiviteten, reducerer cytotoksicitet fra kationiskemembran forstyrrelser og derfor reducerer eksperiment omkostninger. Desuden er cellelevedygtighed og proteinekspression stærkt forbedret ved tilsætning af kultur kosttilskud til at levere glucose og vitaminer. Vigtigere til produktion af glycosylerede proteiner, behandling med kifunensine, en ikke-toksisk kemisk inhibitor af mannosidase I, producerer proteiner med definerede, umodne glycaner, som kan fjernes ved endoglycosidase EndoHf til opnåelse af proteiner med et enkelt N-acetylglucosamin i stedet for en fuld-længde N-forbundet glycan 6. Endelig sekretionen af proteiner i et serumfrit, kemisk defineret medium tillader hurtig og let oprensning for strukturelle og biokemiske undersøgelser. Enkelt trin nikkel-nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) harpiks rensning fjerner størstedelen af kontaminerende arter i supernatanten, og i nogle tilfælde kan give protein af tilstrækkelig renhed til krystallisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F celler tilbyder robust produktion af proteiner, der kræver post-translationelle modifikationer. Dette system muliggør en hurtig og skalerbar ekspression af nativt foldede proteiner indeholdende disulfider, glycosylering og phosphorylering, som ellers ville være fraværende ved hjælp af flere rutinemæssige udtryk værktøjer. Desuden kan dette system anvendes til ekspression og oprensning af multi-proteinkomplekser blot ved co-transfektion af flere plasmider. Udover TREM2, er dette system blevet flittigt br…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
