Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Inzicht eiwitstructuur op atomair niveau is de sleutel tot het blootleggen van de moleculaire basis van biologische processen en ziekten. X-ray kristallografie eiwit is het meest gebruikte / toepasbare methode voor de bepaling van macromoleculaire structuren. De belangrijkste uitdaging van deze methode is het verkrijgen van voldoende hoeveelheden correct gevouwen, zuiver eiwit. Dit wordt een probleem in het bijzonder bij het werken met uitgescheiden eiwitten van zoogdieren, welke specifieke post-translationele modificaties ondergaan.
Bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten zijn de primaire bron van de gekristalliseerde eiwitten gedeponeerd in de Protein Data Bank 1. Bacteriële expressiesystemen zijn grotendeels de voorkeur omdat zij snel, goedkoop en typisch van hoge opbrengsten aan eiwit. Echter, extracellulaire domeinen van zoogdiereiwitten expressie in bacteriën vaak niet goed gevouwen, waarbij opnieuw vouwen en uitgebreide zuiveringsstappen nodig zijn voorliet verkrijgen homogeen folded eiwit. Bovendien, veel zoogdiereiwitten vereisen posttranslationele glycosylering op correcte vouwing 2 bereiken. Hoewel expressie en glycosylering in gist of insectencellen kunnen overwinnen van de problemen vouwen, post-translationele modificaties, zoals glycosylering, verschillen aanzienlijk van die van zoogdiercellen 3, waardoor eiwitten onjuiste of niet-homogene modificaties.
Zoogdierlijke cellen brengen de vereiste moleculaire machinerie te zorgen voor een juiste post- translationele modificaties en vouwen; Echter, deze expressiesystemen niet typisch voorkeur van de meeste laboratoria, vanwege de beperkte opbrengsten en hoge kosten van reagentia en hulpstoffen. Polyethyleenimine (PEI), een standaard transfectie reagens is relatief goedkoop, maar legt aanzienlijke cytotoxiciteit en lage transfectie efficiëntie, resulterend in verhoogde kosten celmedia, DNA en kweken materiaal. Veel alternatieven voor PEI zijn onbetaalbaar. We pakkendeze problemen door het beschrijven van een combinatie van verbeterde celcultuur gereedschappen en chemisch gemodificeerde PEI voor de snelle en relatief goedkope werkwijze voor de expressie van gesecreteerde zoogdiereiwitten, gevolgd door enkelvoudige stap zuivering. Deze robuuste methode geeft voldoende opbrengst van functionele en biochemische studies 4, en in sommige gevallen resulteert in eiwitten vatbaar voor kristallisatie zonder verdere zuivering.
Dit protocol beschrijft verschillende technieken om expressie te optimaliseren en de opbrengst van uitgescheiden zoogdiereiwitten in humane embryonale nier (HEK) 293F cellen gekweekt in suspensie. Transfectie-efficiëntie (en kosten), eiwitproductie en zuivering zijn allemaal sterk verbeterd door het volgen van dit protocol. PEI gemodificeerd door de toevoeging van carbamaten door middel van een eenstaps ringopeningsreactie (PEI-TMC-25, synthese en eigenschappen in detail beschreven in referentie 5) verbetert transfectie-efficiëntie, vermindert de cytotoxiciteit van kationischemembraan verstoring en dienovereenkomstig vermindert experiment kosten. Bovendien worden cellevensvatbaarheid en eiwitexpressie sterk verbeterd met de toevoeging van cultuur aanvullingen op glucose en vitaminen leveren. Belangrijk voor de productie van geglycosyleerde eiwitten behandeling met kifunensine een niet-giftige chemische remmer van mannosidase I, produceert eiwitten met gedefinieerde, onrijpe glycanen die kan worden verwijderd door endoglycosidase EndoHf om eiwitten te leveren met een N-acetylglucosamine in plaats van een full-length N-gelinkte glycan 6. Tenslotte, de uitscheiding van eiwitten in een serumvrij, chemisch gedefinieerd medium maakt een snelle en gemakkelijke zuivering structurele en biochemische studies. Single-step nikkel-nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) hars zuivering verwijdert de meeste verontreinigende soorten in de bovenstaande vloeistof en in sommige gevallen kunnen eiwit voldoende zuiver verkregen voor kristallisatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F cellen bieden robuuste productie van eiwitten die posttranslationele modificaties. Dit systeem maakt een snelle en schaalbare expressie van natief gevouwen eiwitten die disulfiden, glycosylering, en fosforylering die anders afwezig zou zijn het gebruik van meer routine expressie gereedschappen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor de expressie en zuivering van multi-eiwit complexen eenvoudig door co-transfectie van meerdere plasmiden. Naast TREM2, heeft dit systeem uitgebreid gebruikt voor functionele…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
