कुशल स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति और क्रिस्टलीकरण के लिए कोशिकी glycoproteins की एकल कदम शुद्धीकरण
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
एक स्तर पर परमाणु प्रोटीन संरचना को समझने के जैविक रास्ते और रोगों के आणविक आधार को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक्स-रे क्रि प्रोटीन अणुओं संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया / लागू विधि है। इस विधि की मुख्य चुनौती ठीक से मुड़ा हुआ, शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त है। यह विशेष रूप से विशिष्ट बाद translational संशोधनों से गुजरना जो स्रावी स्तनधारी प्रोटीन, साथ कार्य करते समय एक मुद्दा बन जाता है।
Bacterially-व्यक्त प्रोटीन प्रोटीन डाटा बैंक 1 में जमा सघन प्रोटीन का प्राथमिक स्रोत हैं। वे सस्ती, उपवास कर रहे हैं और आम तौर पर प्रोटीन की उच्च पैदावार का उत्पादन क्योंकि बैक्टीरियल अभिव्यक्ति सिस्टम काफी हद तक पसंद कर रहे हैं। हालांकि, बैक्टीरिया में व्यक्त स्तनधारी प्रोटीन के बाह्य डोमेन अक्सर ठीक लिए ही ढंग से प्राप्त करने के लिए जो मामले refolding और व्यापक शुद्धि चरणों आवश्यक हैं, मुड़ा नहीं कर रहे हैंlded प्रोटीन। इसके अतिरिक्त, कई स्तनधारी प्रोटीन उचित तह 2 को प्राप्त करने के बाद translational ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता होती है। खमीर या कीट कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और ग्लाइकोसिलेशन तह समस्या को दूर कर सकते हैं, ग्लाइकोसिलेशन सहित बाद translational संशोधनों, गलत या गैर सजातीय संशोधनों के साथ प्रोटीन उपज, स्तनधारी कोशिकाओं 3 के उन लोगों से काफी अलग हैं।
स्तनधारी कोशिकाओं उचित बाद translational संशोधनों और तह सुनिश्चित करने के लिए सभी आवश्यक आणविक मशीनरी व्यक्त; हालांकि, इन अभिव्यक्ति की प्रणाली आम तौर कारण सीमित पैदावार और अभिकर्मकों और उपभोक्ता वस्तुओं की उच्च लागत के लिए, सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा पसंद नहीं कर रहे हैं। Polyethyleneimine (पी), एक मानक अभिकर्मक अभिकर्मक अपेक्षाकृत सस्ता है लेकिन काफी cytotoxicity और कम अभिकर्मक दक्षता, सेल मीडिया, डीएनए में वृद्धि की लागत में जिसके परिणामस्वरूप, और उपकरणों संवर्धन लगाता है। पी के लिए कई विकल्प बेहद महंगे हैं। हम पतामें सुधार सेल संस्कृति उपकरणों का एक संयोजन का वर्णन है और रासायनिक एकल कदम शुद्धि के बाद, स्रावित स्तनधारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए त्वरित और अपेक्षाकृत सस्ती विधि के लिए पी संशोधित करके इन मुद्दों। यह मजबूत विधि कार्यात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन 4 के लिए पर्याप्त पैदावार देता है, और कुछ मामलों में, आगे की शुद्धि के बिना क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी प्रोटीन में यह परिणाम है।
इस प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति को अधिकतम करने और निलंबन में विकसित मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) में स्रावित स्तनधारी प्रोटीन 293F कोशिकाओं के लिए उपज के लिए कई तकनीकों का वर्णन है। अभिकर्मक दक्षता (और लागत), प्रोटीन के उत्पादन और शोधन सब बहुत इस प्रोटोकॉल के बाद से बढ़ा रहे हैं। एक एकल कदम अंगूठी खोलने प्रतिक्रिया के माध्यम से Carbamates के अलावा द्वारा संशोधित पी (पी-टीएमसी -25, रेफरी 5 में विस्तार से वर्णित संश्लेषण और गुण) बहुत अभिकर्मक दक्षता में सुधार cationic से cytotoxicity कम कर देता हैतदनुसार झिल्ली विघटन और प्रयोग की लागत कम कर देता है। इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता और प्रोटीन अभिव्यक्ति बहुत ग्लूकोज और विटामिन की आपूर्ति करने के लिए संस्कृति की खुराक के अलावा के साथ सुधार कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है kifunensine साथ ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, उपचार के उत्पादन के लिए, Mannosidase मैं की एक गैर विषैले रासायनिक अवरोध करनेवाला, के स्थान पर एक एकल एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन के साथ प्रोटीन की उपज के लिए endoglycosidase EndoHf द्वारा हटाया जा सकता है, जो परिभाषित, अपरिपक्व ग्लाइकान, साथ प्रोटीन का उत्पादन एक पूरी लंबाई की glycan 6 एन से जुड़े। अंत में, एक सीरम मुक्त, रासायनिक परिभाषित माध्यम में प्रोटीन का स्राव संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए तेजी से और सतही शुद्धि की अनुमति देता है। एकल कदम निकल nitrilotriacetic एसिड (नी NTA) राल शुद्धि कुछ मामलों में, क्रिस्टलीकरण के लिए पर्याप्त शुद्धता के प्रोटीन उपज कर सकते हैं, सतह पर तैरनेवाला में प्रजातियों को दूषित और के बहुमत को हटा।
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F कोशिकाओं बाद translational संशोधनों की आवश्यकता होती है प्रोटीन के मजबूत उत्पादन करते हैं। इस प्रणाली disulfides, ग्लाइकोसिलेशन, और नहीं तो और अधिक दिनचर्या अभिव्यक्ति उपकरण का उपयोग कर अनुपस्थित होगा कि फास्फो…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
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