Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

Ingegneria tissutale cardiaca ha avanzato enormemente negli ultimi dieci anni, con più gruppi editoriali risultati completamente funzionale, tessuti battendo realizzati da entrambi i cardiomiociti murini ^1-6 e, più recentemente, umani cellule staminali derivate miociti cardiaci ^7-12. Il campo di ingegneria dei tessuti cardiaco è guidata da due obiettivi primari e sostanzialmente indipendenti: 1) per sviluppare innesti esogeni che possono essere trapiantate in mancanza di cuori per migliorare la funzione ^4-6; e 2) sviluppare modelli in vitro per lo studio fisiologia e malattie, o come strumenti di screening per sviluppo terapeutico ^2,7.

Tridimensionale (3-D) coltura cellulare è considerata essenziale per lo sviluppo di strumenti di screening di nuova generazione, come la matrice 3-D riflette un microambiente cardiaco più naturale di coltura cellulare monostrato 2-D tradizionali; infatti alcuni aspetti della biologia cellulare sono fondamentalmente differenti in 2-D vs 3-D culture ^13,14 </sup>. Inoltre, i tessuti cardiaci ingegnerizzati sono costruiti da componenti completamente definite: una matrice extracellulare, e una popolazione di cellule. Per i tessuti cardiaci umani ingegnerizzati tradizionali, mentre la composizione della matrice extracellulare (solitamente fibrina ⁹ o collagene ^7,8,10) è strettamente controllato, la composizione cella di input è meno ben definita, con l'intera miscela di cellule da una differenziazione cardiaca diretto di entrambi le cellule staminali embrionali (ESC ^7,9) o di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC ^10,12) che viene aggiunto ai tessuti. A seconda della linea cellulare specifica e l'efficienza del protocollo differenziazione utilizzato, la percentuale risultante dei cardiomiociti può variare da meno del 25% a oltre il 90%, il fenotipo specifico cardiomiociti (cioè, ventricular-, atrial- o pacemaker-like) può anche variare, anche la frazione non cardiomiociti può essere molto eterogenea ^15,16 e alterare la maturità del differenziata m cardiacoyocytes ^17.

Recenti cardiaco lavoro ingegneria dei tessuti ha tentato di controllare la popolazione di ingresso di cellule, sia con un reporter cardiaco linea di cellule staminali embrionali umane ⁸ o cellule superficie marcatori ¹⁸ viene utilizzato per isolare la componente dei miociti cardiaci della differenziazione. Mentre inizialmente un tessuto composto da sole miociti cardiaci sembra essere l'ideale, questo è infatti il ​​caso; hECTs composte unicamente da miociti cardiaci non riescono a compattare nei tessuti funzionali, con alcuni gruppi di trovare un rapporto 3: 1 di miociti cardiaci: fibroblasti che producono la più alta forza di contrazione ^8. Utilizzando diversi metodi di selezione delle cellule, compresi marcatori di superficie per l'ordinamento delle cellule vive, è possibile creare hECTs con popolazioni cellulari definiti. Mentre marcatori di cellule stromali non cardiaci sono stati disponibili per un certo tempo, come il marcatore CD90 fibroblasti putativo ^19,20, marcatori di superficie di miociti cardiaci sono stati più difficiliper identificare. SIRPα è stato tra i primi marcatori di superficie cardiaci identificati per miociti cardiaci umani ¹⁸ e ha dimostrato di essere altamente selettivo per il lignaggio cardiaco. Recentemente, abbiamo scoperto che in doppio ordinamento per SIRPα ⁺ e CD90 ^– cellule rese cardiomiociti quasi puro, con il CD90 ⁺ popolazione che presenta una fibroblasti simile fenotipo (Josowitz, osservazioni non pubblicate). Sulla base di questi risultati raccolti, qui descriviamo la creazione hECTs con un 3: 1 combinazione di SIRPα ⁺ / CD90 ^– cardiomiociti e fibroblasti CD90 ^+.

La capacità di progettare un tessuto cardiaco umano completamente definita è essenziale non solo per la creazione di solidi strumenti di screening, ma anche per lo sviluppo di sistemi modello per indagare cellulo emergente e le terapie cardiache gene-based. In particolare, numerose terapie cellulari per insufficienza cardiaca, utilizzando tipi di cellule tra cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) ²¹ </sup>, le cellule staminali cardiache ²² e cellule mononucleari del midollo osseo ^23-25, sono stati testati in studi clinici. Mentre molti dei risultati iniziali sono stati promettenti ^21,23,25, il vantaggio iniziale, spesso diminuisce nel tempo ^26-29. Una tendenza simile è stata riportata in murini ingegnerizzato tessuto cardiaco, che mostrano un significativo beneficio funzionale a causa di supplementazione di MSC, ma il beneficio non è sostenuta durante la coltura a lungo termine ^1. Alla base le prestazioni sub-ottimali è la nostra limitata conoscenza dei meccanismi che regolano terapie cellulari. Una più profonda comprensione di come le cellule terapeutico esercitare la loro influenza benefica, nonché possibili conseguenze negative delle interazioni miociti-nonmyocyte, consentirebbe lo sviluppo di terapie migliorate ottenendo benefici clinicamente significativi e sostenuti, con effetti collaterali minimi, per i pazienti con insufficienza cardiaca.

Qui, descriviamo l'uso di hECTs definite a Esamate meccanismi di terapia cellulare. La composizione del tessuto controllato è essenziale per identificare i fattori specifici che influenzano le prestazioni dei cardiomiociti. Direttamente integrazione hECTs con il tipo di cellule terapeutiche di interesse (ad esempio, MSC), può rivelare gli effetti sulle prestazioni dei miociti cardiaci, come abbiamo dimostrato in crediti ECTS ratto ^1.

Il seguente protocollo multi-step inizia con diretto differenziazione delle cellule staminali cardiache, seguita dalla realizzazione del bioreattore multi-tessuto, e concludere con una descrizione di costruzione dei tessuti e analisi funzionale. I nostri esperimenti vengono eseguiti utilizzando la linea NIH-approvato H7 cellule staminali embrionali umane (hESC). Tuttavia, i seguenti protocolli sono anche stati testati utilizzando una linea hESC aggiuntivo e tre linee di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) con risultati simili. Abbiamo scoperto che l'efficienza nella differenziazione dei cardiomiociti e il successo in hect fabbricazione può essere linea cellulare dipendente, in particolare folinee r hiPSC derivati ​​da singoli pazienti. Seguendo questo protocollo, due piatti 6 pozzetti sono placcati con un totale di 1,68 milioni di hESC (140.000 cellule per pozzetto), che produce circa 2,5 milioni di miociti dopo differenziazione per 20 giorni e l'ordinamento, abbastanza per fare sei tessuti definiti.

Protocol

Nota: eseguire tutte le manipolazioni di cellule in condizioni asettiche con una classe II cappa di sicurezza biologica HEPA filtrata e sterilizzare tutte le soluzioni da filtrandoli attraverso un filtro 0,2 micron. Esegui creazione tessuti e collaudo funzione sia stesse condizioni asettiche o una cappa a flusso laminare. 1. Semina di H7 hESC in preparazione differenziazione cardiaca (Giorno 1) Preparazione della matrice di membrana basale Scongelare 150 ml aliquota di hE…

Representative Results

Per ottenere miociti cardiaci, una versione leggermente modificata dei metodi di differenziazione Boheler e Lian viene utilizzata 30,31. È indispensabile che la differenziazione inizia durante il log-fase di crescita delle cellule, ma anche che la popolazione di partenza è sufficientemente confluenti di ottenere un numero utilizzabile di celle dopo ordinamento (circa il 75% è ottimale). Tipicamente, per H7 hESCs, placcatura con una densità di 140.000 hESC per pozzetto di un piatto 6 pozzetti in essenziali…

Discussion

Costruzione di tessuti umani ingegnerizzati definiti cardiaci (hect) in grado di fornire un modello più coerente e affidabile della funzione dei miociti cardiaci umana. Criticamente, tutti componenti cellulari ed extracellulari nel sistema sono noti e possono essere manipolati come desiderato, eliminando così l'influenza confondenti di altri tipi di cellule sconosciuti risultanti dal processo di differenziazione. Per bilanciare la crescita cellulare rapida e ad alto rendimento, è preferibile che la differenziazio…

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors