Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

Cardiac tissue engineering har avancerede kraftigt i det seneste årti, med flere grupper som publicerer resultaterne af fuldt funktionelle, slå væv fremstillet af både murine cardiomyocytter ^1-6 og senest, menneskelige stamcelle-afledte hjertemyocytter ^7-12. Den hjertevævet ingeniørområdet er drevet af to primære og væsentlige uafhængige mål: 1) at udvikle eksogene podninger, der kan transplanteres ind i svigtende hjerter til at forbedre funktionen ^4-6; og 2) at udvikle in vitro modeller til at studere fysiologi og sygdom, eller som screening-værktøjer til terapeutisk udvikling ^2,7.

Tre-dimensionel (3-D) cellekultur betragtes som afgørende for at udvikle næste generation af screening-værktøjer, som 3-D matrix afspejler en mere naturlig hjerte-mikromiljø end traditionelle 2-D monolag cellekultur; faktisk nogle aspekter af cellebiologi er fundamentalt anderledes i 2-D vs. 3-D kulturer ^13,14 </sup>. Derudover er manipuleret hjertevæv konstrueret af helt definerede komponenter: en ekstracellulær matrix, og en cellepopulation. For traditionelle manipuleret humane hjertevæv, mens den ekstracellulære matrix sammensætning (normalt fibrin ⁹ eller kollagen ^7,8,10) er strengt kontrolleret, input cellesammensætning er mindre veldefineret, med hele blandingen af celler fra en rettet hjertedifferentiering af enten embryonale stamceller (ESC ^7,9) eller inducerede pluripotente stamceller (IPSC ^10,12) er tilsat til vævene. Afhængigt af den specifikke cellelinie og effektiviteten af differentiering anvendte protokol, kan den resulterende procentdel af cardiomyocytter variere fra mindre end 25% til over 90% af den specifikke cardiomyocyte fænotype (dvs. ventricular-, atrial- eller pacemaker-lignende) kan også variere, selv de ikke-cardiomyocyte fraktion kan være meget heterogen ^15,16 og ændre løbetiden for den differentierede hjerte- myocytes ^17.

Nylige hjertevæv ingeniørarbejde har forsøgt at styre input population af celler, med enten en human embryonal stamcelle linje kardial reporter ⁸ eller celleoverflademarkører ¹⁸ er anvendt til at isolere den hjertemyocyt komponent af differentiering. Mens det i begyndelsen et væv sammensat af kun hjertemyocytter synes at være det ideelle, dette er i virkeligheden ikke tilfældet; hECTs udelukkende består af hjertemyocytter undlader at komprimere i funktionelle væv, med nogle grupper finde en 3: 1-forhold mellem hjertemyocytter: fibroblaster producerer den højeste ryk kraft ^8. Ved hjælp af forskellige celleadskillelsesmetoder, herunder overflademarkører for levende cellesortering, er det muligt at skabe hECTs med definerede cellepopulationer. Mens markører for ikke-kardiale stromaceller har været tilgængelige i nogen tid, såsom det formodede fibroblast markør CD90 ^19,20, har overflademarkører af hjertemyocytter været vanskeligereat identificere. SIRPα var blandt de første kardiale overflademarkører identificeret for humane hjertemyocytter ¹⁸ og har vist sig at være yderst selektiv for hjertets afstamning. For nylig har vi fundet, at dobbelt-sortering for SIRPα ⁺ og CD90 ^– celler giver næsten rene cardiomyocytter, med CD90 ⁺ population udviser en fibroblastlignende fænotype (Josowitz, upublicerede observationer). Baseret på disse indsamlede resultater, heri beskriver vi skabe hECTs anvendelse af en 3: 1 blanding af SIRPα ⁺ / CD90 ^– cardiomyocytter og CD90 ⁺ fibroblaster.

Evnen til at konstruere en helt defineret menneske hjertevæv er afgørende ikke kun for at skabe robuste screening-værktøjer, men også for at udvikle modelsystemer til at undersøge nye celle- og genbaserede hjerte- behandlinger. Især talrige celleterapi til hjertesvigt, udnytte celletyper, herunder mesenchymstamceller (MSC) ²¹ </sup>, kardiale stamceller ²² og knoglemarvsceller mononukleære celler ^23-25, er blevet testet i kliniske forsøg. Mens mange af de første resultater er lovende ^21,23,25, den oprindelige ydelse ofte mindskes med tiden ^26-29. En lignende udvikling er blevet rapporteret i murine manipuleret hjertevæv, som viser en betydelig funktionel fordel på grund af MSC tilskud, men fordelen er ikke opretholdes under langvarig kultur ^en. Underliggende sub-optimal ydeevne er vores begrænsede viden om de mekanismer, der styrer celleterapi. En dybere forståelse af, hvordan terapeutisk celler udøve deres gavnlige indflydelse, såvel som potentielle negative konsekvenser af myocyt-nonmyocyte interaktioner, ville muliggøre udviklingen af ​​bedre behandlinger giver klinisk signifikante og vedvarende fordele, med minimale bivirkninger, for patienter med hjertesvigt.

Her beskriver vi brugen af ​​definerede hECTs at interrogspiste mekanismer for celle-baseret behandling. Den kontrollerede væv sammensætning er afgørende for at identificere specifikke faktorer, der påvirker cardiomyocyte ydeevne. Direkte supplere hECTs med den terapeutiske celletype af interesse (f.eks MSC), kan afsløre virkningerne på hjertemyocyt ydeevne, som vi har vist i rotte ECTS ^1.

Følgende multi-trins protokol begynder med rettet cardiac stamcelle differentiering, efterfulgt af fremstilling af multi-væv bioreaktor, og afsluttende med en beskrivelse af væv konstruktion og funktionel analyse. Vores eksperimenter udføres ved hjælp af NIH-godkendte H7 humane embryonale stamceller (embryonale) linje. Imidlertid har de følgende protokoller også blevet testet under anvendelse af en yderligere embryonale linje og tre induceret pluripotente stamcelle (hiPSC) linjer med lignende resultater. Vi har fundet, at effektiviteten i cardiomyocyte differentiering og succes i hek fabrikation kan være cellelinje afhængig, især for hiPSC linjer afledt af individuelle patienter. Ved at følge denne protokol, er to 6-brønds skåle belagt med i alt 1,68 mio hESCs (140.000 celler per brønd), hvilket giver ca. 2,5 millioner myocytter efter differentiering i 20 dage og sortering, nok til at gøre seks definerede væv.

Protocol

Bemærk: Udfør alle celle manipulationer i aseptiske betingelser ved hjælp af et HEPA-filtreret klasse II biologiske sikkerhed kabinet og sterilisere alle løsninger ved at filtrere dem gennem et 0,2 um filter. Udfør væv konstruktion og funktion test i enten den samme aseptiske betingelser eller en laminar flow hætte. 1. Såning af H7 hESCs i Forberedelse til Cardiac Differentiering (Dag 1) Forberedelse basalmembranen Matrix Tø 150 pi alikvot af embryonale kvalifice…

Representative Results

For at opnå hjertemyocytter, er en let modificeret version af Boheler og Lian differentiering metoder 30,31. Det er bydende nødvendigt, at differentieringen starter under log-fase af cellevækst, men også at startpopulationen er tilstrækkeligt konfluent at opnå et brugbart antal celler efter sortering (ca. 75% er optimalt). Typisk for H7 hESCs, udpladning med en tæthed på 140.000 hESCs pr brønd af en 6-brønds skål i væsentlig 8 medier og 5% CO2 inkubator holdt ved 37 ° C giver tilstræk…

Discussion

Konstruktion af definerede humane manipuleret hjertevæv (hek) kan give en mere konsekvent og pålidelig model af menneskets hjertemyocyt funktion. Kritisk, er alle cellulære og ekstracellulære komponenter i systemet kendt og kan manipuleres som ønsket, og dermed fjerne den confounding indflydelsen fra andre ukendte celletyper som følge af differentieringsprocessen. Til afbalancering hurtig cellevækst og højt udbytte, er det foretrukket, at differentieringen starter ved 75% sammenløb af hESCs, ideelt fire dage ef…

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors