טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Summary

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

מיקרואורגניזמים פרוביוטיים הם אמצעי פוטנציאל מסקרן של יעיל וחסכוני ומספק חלבונים Heterologous בבני האדם במערכת העיכול. אורגניזמים אלה מסוגלים לשרוד מעבר דרך מערכת העיכול עדיין לא ליישב אותו ^1, מה שמאפשר מינון מבוקר הגבלת החשיפה לתרופה לידי ביטוי. יתר על כן, את היכולת להנדס אלה אורגניזמים בקלות לייצר חלבון Heterologous בקנה מידה גדול הופך אותם חלופה חסכונית חלקיקי משלוח סינטטיים. עם זאת, פיתוח של גישה כזו, כפי שהודגם לאחרונה באמצעות זן auxotrophic של Saccharomyces שמרים פרוביוטיים ² boulardii, דורש ידע של טכניקות מעבדה לא משולבים באופן מסורתי בתוך מחקר נתון, החל שמרים וביולוגיה מולקולרית לטכניקות טיפול בבעלי חיים ושיטות אימונולוגיות. לכן למרות נהלי הפרט המתוארים כאן אינם כשלעצמם רומןפרוטוקולי מעבדה, מטרה של כתב היד הזה הוא להציג הקדמה מאוחדת לטכניקות דרושי בדיקה ניסיונית של שמרי פרוביוטיים כרכב תרופה ניתנת מערכת עיכול Murine. מסופק הוא אוסף של פרוטוקולים חיוניים: 1) הפקה של זנים מוטנטים auxotrophic של שמרים שיכולים בקלות להיות מניפולציות גנטיות; 2) שינוי של תרביות שמרים להביע חלבון Heterologous; 3) הממשל של שמרים רקומביננטי למעי gavage דרך הפה; ו -4) התאוששות של שמרים פרוביוטיים קיימא רקומביננטי מהמעי murine והערכה של ביטוי חלבון Heterologous שלהם.

ראשית, אם כי שיטות בחירה חיובית ושלילית רבות קיימות עבור המניפולציה של מיני שמרים, סלקציה שלילית כגון באמצעות סמני auxotrophic מגבירה היא את היעילות ואת הקלות שבה שהמרים ניתן להפוך נבחר. סלקציה חיובית של transformants באמצעות אנטיביוטיקה, בשיתוףntrast, מגביר באופן משמעותי את העלות של מניפולציה שמרים. יתר על כן, בחירה של שמרים על תקשורת מוצקה המכילה אנטיביוטיקה יכולה לאפשר צמיחה מוגברת של מושבות רקע untransformed ביחס בחירה של שמרי auxotrophic על ירידה סינטתית החוצה תקשורת מוצקה (תצפיות לא פורסם). שמרי Auxotrophic הם זנים אשר חסרים אנזימים קריטיים לסינתזה של חומצות או אורציל האמינו חיוניות. כזה שמרים יכולים לגדול רק אם השלים עם המטבוליט החסר או גני מטבוליים, ובכך לאפשר סלקציה שלילית כאשר שמרים מצופית על ירידה סינטתית החוצה תקשורת כי חסרה את המטבוליט החיוני. רבים נפוצים זני מעבדת שמר אפייה הם למעשה כבר auxotrophic מוטנטים ^3. תעשייתי, קליני, ואת זני שמרים פרוביוטיים, לעומת זאת, הם בדרך כלל prototrophic עם היכולת לסנתז את כל החומרים המזינים הנדרשים. כדי לאפשר מניפולציה גנטית יעילה יותר של שמרים כאלה, גני auxotrophic ניתן לכוון באופן סלקטיביכדי ליצור זנים שיכולים להיבחר ללא אנטיביוטיקה. מיקוד ספציפי של גני סמן auxotrophic יכול להיות מושג באמצעות שיבוש גנטי בתיווך PCR להסתמך על רקומבינציה הומולוגי או ולאחרונה דרך CRISPR / Cas9 מיקוד ^{4 – 6.} לחלופין, mutagenesis UV יכול במהירות ליצור מוטציות auxotrophic אפילו זני שמרים עבורו טרנספורמציה עם פלסמידים מרובים מבחינה טכנית קשה ^7. למרות שהמיקוד PCR ו CRISPR / Cas9 תוארו בהרחבה במקומות אחרים, המופיעים בחלק אחד של כתב היד הזה הוא פרוטוקול מפורט המתאר גישה mutagenesis UV כדי ליצור זנים auxotrophic שיאפשרו סלקציה שלילית ולא חיובית מבחר אנטיביוטי של transformants שמרים.

הצעד הכרחי הבא בשימוש זנים auxotrophic כזה למסירה אוראלי של חלבון Heterologous הוא טרנספורמציה שמרים עם DNA פלסמיד. מאז השינוי המוצלח הראשון של עצירהspheroplasts t ודווח שמר האפייה בשנת 1978 ^8, שינויים רבים מתאפיינים כדי להגביר את היעילות ואת הקלות שבה מינים שמרים יכולים להיות מהונדסים גנטית. השימוש electroporation עבור טרנספורמציה מוצלחת של ה- DNA לתוך ס cerevisiae תואר לראשונה בשנת 1985 ⁹ ומאז שופר באמצעות התוספת של 1 M דגירת סורביטול לתאי התמיכה אוסמוטי ^10. יעילות Electroporation יתר הוכח תלוי מינים שמרים ומתח, מספר תא בשלב של צמיחה, נפח electroporation, עוצמת שדה, או מאגר ספציפי ^11. הטרנספורמציה יצטט ליתיום (LiOAc), תארה במקור על ידי איטו et al. ^12, היא בין פרוטוקולי השינוי הנפוצים ביותר כפי שהוא דורש שום ציוד מיוחד. ניתוחים נוספים הראו כי יעילות הטרנספורמציה שמרים LiOAc מגדיל מאוד כאשר התאים נאספים בשלב אמצע יומןהצמיחה וחום מזדעזעים בנוכחות פוליאתילן גליקול (PEG) ו- DNA על 42 מעלות צלזיוס ^12. דגירה של שמרים שלמים ללא רבב עם PEG חיונית שינוי יעיל, ואולי באמצעות שיפור מצורף של DNA על קרום תא, כמו גם באמצעות אפקטים אחרים על הממברנה ^13. ליתיום עצמו גם מעלה את החדירות של תאים שלמים ^14. למרות שרוב המעבדה ס זני cerevisiae ניתן להפוך בקלות באמצעות LiOAc טרנספורמציה ^3, מיני שמרים אחרים עשויים להשתנות בצורה יעילה יותר תוך שימוש בפרוטוקולים חלופי. pastoris Pichia, למשל, הוא הכי טרנספורמציה ביעילות דרך electroporation ולא טרנספורמציה LiOAc ^13. זה חיוני, אפוא, לבדוק מספר שיטות של שינוי וכדי לייעל תקופות דגירה וריכוזיות מגיב כאשר מנסים לשנות גנטי זן שמרי uncharacterized. כתב יד זה וכך מתאר הוא LiOAc transformation ו electroporation כמו טכניקות הטרנספורמציה של מוטציה auxotrophic וסוג בר ס boulardii. קוראים מעוניינים מופנים סקירות אחרונות לתיאורים יסודיים של האבולוציה של טרנספורמציה שמרים, פרוטוקולים חלופיים, ודיונים נוספים של מנגנוני פעולה אפשריים ^13,15. טרנספורמציה של שמרים עם קידוד פלסמיד חלבון שניתן לזיהוי בקלות הוא יתר חיוני לבדיקה במורד הזרם כדי להבטיח ביטוי הולם ותפקוד של חלבון Heterologous. חלבונים השונים מיריאד ניתן לבחור בהתאם את המטרה הסופית של המחקר הטיפולי ואת הנוגדנים זמינים לגילוי חלבון על ידי immunoblotting, ELISA, וטכניקות אחרות. פרוטוקולים עבור טכניקות אלו תוארו ביסודיות במקום אחר ^16,17, והוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות של ייצור חלבון Heterologous משמרים טרנספורמציה בהשוואת עקומות סטנדרטיות. להדגמה ולהראותייצור מוצלח של חלבון מאוד נפוץ בביולוגיה שמרים, כתב היד הזה מציג טרנספורמציה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק קידוד פלסמיד (GFP), אשר מאפשר זיהוי שלאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לא פחות חשוב בייצור של אורגניזמים פרוביוטיים המבטאים חלבון Heterologous הוא המנהל תקין זיהוי של מיקרואורגניזמים אלה בתוך רקמות עיכול, כמתואר חלק שלושה וארבעה. מנהל של שמרי רקומביננטי gavage דרך הפה מאפשר אספקה ​​של כמויות מבוקרות של שמרים ישירות לקיבה, שממנו C57BL / 6 עכברים אינן מסוגלות באופן טבעי של הקאות ^18. עם זאת, טיפול בבעלי חיים פסולים gavage עלולים להביא לניזק ושט ניקוב, ניקוב קיבה, ממשל קנה נשימה, ושאיפת דלקת ריאות ^19,20. טכניקה וחוסר ניסיון מסכנה יתר יכולים להגדיל השתנות בתגובות murine חיסוניות resu הניסיוןLTS, אשר יוחס מתח חיה על gavage פי ^21,22. עיסוק בטכניקה הנכונה ולכן לא יכול רק להחליש חוסר נוחות לבעל חיים, אלא גם יכול להגדיל את הדיוק של תוצאות ניסוי. כתב יד זה מתאר ומדגים טיפול בבעלי חיים ו gavage הפה עבור הממשל של מינונים מבוקרים של שמרים רקומביננטי.

לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר מסירה מוצלחת של שמרי רקומביננטי ידי ניתוח רקמות הלימפה לנוכחות שמרים וחלבון Heterologous. הרקמות החיסוניות העיכול שיכול בקלות על וכצפוי להיבדק לנוכחות של שמרים הן הטלאים של Peyer. טלאים של Peyer הם איברים הלימפה משני לאורך המעי הדק כי הם אתרים מרכזיים של אינדוקציה התגובה החיסונית ברירית ^23. אנטיגנים מן לומן מועברים transcellularly דרך microfold (M) תאי האפיתל ומשתחררים לתוך טלאים של Peyer, ובכך חושפים הקףאנטיגן ד הצגה לתאי מעי תוכן לומינל. למרות ספיגת חלקיקים על פני האפיתל במעי יכול גם להיות מושגת על ידי תאי גביע, תאים אלה הוכחו חלקיקים תופסים רק פחות מ 0.02 מיקרומטר בקוטר ^24. דנדריטים Transepithelial הוארכו מ CD103 ⁺ תאים דנדריטים (DC) גם תופס חלקיקים קטנים מן המעי לומן ^25; עם זאת, אין כיום דיווחים הוכחת כי CD103 ⁺ DCs תופס חלקיקים גדולים יותר מאשר חיידקים. לכן, ללא שינוי שמרים פרוביוטיים, בגודל ממוצע בין 3-6 מיקרומטר קוטר, הם הסיכוי הטוב ביותר להיות נלקח על ידי תאים M והועבר טלאים של Peyer. מתואר כאן הוא פרוטוקול לאיסוף והקרנת הטלאים של Peyer עבור שמרי רקומביננטי קיימא, למרות ההליך זה יכול גם להיות מותאם בקלות להערכת ספיגה של חיידקים פרוביוטיים.

לסיכום, להערכת שמרים פרוביוטיים רקומביננטי עבור משלוח שלחלבונים rapeutic למעי דורש מיומנות בטכניקות מעבדה פורש ביולוגיה מולקולרית כדי טיפול ואימונולוגיה חיה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן הם עבור 1) הדור והקרנת זני שמרים auxotrophic אשר ניתן לבחור באופן שלילי בקלות ללא אנטיביוטיקה, 2) פרוטוקולים חלופיים להפוך שמרים ולאפשר ביטוי חלבון Heterologous, 3) הפגנות של טכניקות טיפול בבעלי חיים נאותה gavage אוראלי משלוח intragastric של שמרים רקומביננטי, ופרוטוקולים 4) לנתיחה תיקון של Peyer וסינון עבור שמרים רקומביננטי קיימא וחלבון Heterologous פונקציונלי. בשילוב, פרוטוקולים אלה יאפשרו לדור ובדיקה של זן שמרים פרוביוטיים מסוגל לספק החלבון התרופתי Heterologous בבני האדם במערכת העיכול.

Protocol

1. mutagenesis UV כדי ליצור זני שמרים Auxotrophic צור עקומות הישרדות לקבוע המנות הדרושות של קרינה UV כן YPD (דקסטרוז peptone תמצית שמרים) תקשורת ריאגנטים אחרים המפורטים בטבלה <stron…

Representative Results

דור של עקומת הישרדות בעקבות הקרינה UV דורש ציפוי של תאי שמרים מדוללים כך להרכיב יחידות מושבה ברורות (CFU) מסוגלות ליצור. כל דגימה 500 μl שנאספו כמתואר לעיל מכיל כ 5 x 10 6 תאים; עם זאת, יותר מ -100 מושבות בכל צלחת שקשה להבחין במדויק. ציפוי מדגם חי וכן דילול?…

Discussion

יחד, הפרוטוקולים בזאת לתאר את הצעדים החיוניים הדרושים לפיתוח ובדיקה של זני שמרים פרוביוטיים auxotrophic למסירה של החלבון התרופתי Heterologous אל המעי. מניפולציה ובדיקה זו של שמרי פרוביוטיים רקומביננטי דורשים טכניקות ומשאבים שבה כל מעבדת פרט לא יכול כרגע להיות מוכרות. לכן, למרו…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053