प्रोबायोटिक खमीर के परिवर्तन और जठरांत्र इम्यून ऊतकों से उनके वसूली चूहे में मौखिक Gavage के बाद

Summary

यहाँ प्रस्तुत तकनीकों कि, विकसित करने के लिए बदलने, प्रशासन, और प्रोबायोटिक खमीर Saccharomyces boulardii की heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति का परीक्षण किया जा सकता है के लिए एक एकीकृत वर्णन है।

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

प्रोबायोटिक सूक्ष्मजीवों कुशलतापूर्वक और आर्थिक रूप से जठरांत्र संबंधी मार्ग को heterologous प्रोटीन पहुंचाने की एक साज़िश संभावित साधन हैं। इन जीवों जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से पारित होने के जीवित रहने का अभी तक यह ¹ उपनिवेश नहीं है, नियंत्रित खुराक सक्षम करने और जोखिम को सीमित करने के लिए दवा व्यक्त करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, आसानी से इन जीवों इंजीनियर करने के लिए बड़े पैमाने पर heterologous प्रोटीन उत्पादन करने की क्षमता उनमें सिंथेटिक वितरण कणों के लिए एक किफायती विकल्प प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण के विकास, के रूप में हाल ही में boulardii ² प्रोबायोटिक खमीर Saccharomyces की एक auxotrophic तनाव का उपयोग का प्रदर्शन किया, प्रयोगशाला तकनीक पारंपरिक रूप से एक दिए गए अध्ययन के भीतर संयुक्त नहीं, खमीर और आणविक जीव विज्ञान से जानवर से निपटने की तकनीक और तरीकों को लेकर प्रतिरक्षा के ज्ञान की आवश्यकता है। इस प्रकार, हालांकि अलग-अलग वर्णित प्रक्रियाओं को खुद में उपन्यास नहीं हैंप्रयोगशाला प्रोटोकॉल, इस पांडुलिपि के लक्ष्य murine जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए दवा वितरण वाहनों के रूप में प्रोबायोटिक खमीर के प्रायोगिक परीक्षण के लिए आवश्यक तकनीक के लिए एक एकीकृत परिचय प्रस्तुत करने के लिए है। परंतु लिए आवश्यक प्रोटोकॉल का एक संकलन है: 1) खमीर की auxotrophic उत्परिवर्ती उपभेदों कि आनुवंशिक रूप से आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती की पीढ़ी; 2) खमीर संस्कृतियों के परिवर्तन heterologous प्रोटीन व्यक्त करने के लिए; 3) मौखिक gavage के माध्यम से आंत के लिए पुनः संयोजक खमीर के प्रशासन; और 4) murine आंत और उनके heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के आकलन से व्यवहार्य पुनः संयोजक प्रोबायोटिक खमीर की वसूली।

सबसे पहले, हालांकि कई सकारात्मक और नकारात्मक चयन के तरीकों खमीर प्रजातियों के हेरफेर के लिए मौजूद हैं, ऐसे auxotrophic मार्कर के उपयोग के माध्यम के रूप में नकारात्मक चयन दोनों दक्षता और जिसके साथ खमीर बदल दिया है और चयनित किया जा सकता आसानी बढ़ जाती है। एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर transformants की सकारात्मक चयन, सह मेंntrast, काफी खमीर में गड़बड़ी की लागत बढ़ जाती है। इसके अलावा, एंटीबायोटिक युक्त ठोस मीडिया पर खमीर का चयन सिंथेटिक ड्रॉप आउट ठोस मीडिया (अप्रकाशित टिप्पणियों) पर auxotrophic खमीर के चयन के सापेक्ष untransformed पृष्ठभूमि कालोनियों की वृद्धि हुई वृद्धि के लिए अनुमति दे सकते हैं। Auxotrophic खमीर उपभेदों जो आवश्यक अमीनो एसिड या uracil के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण एंजाइमों की कमी है। ऐसे खमीर केवल विकसित कर सकते हैं, तो याद आ रही मेटाबोलाइट या चयापचय जीन के साथ पूरक है, इस प्रकार नकारात्मक चयन को सक्षम करने के लिए जब खमीर बाहर मीडिया सिंथेटिक ड्रॉप है कि आवश्यक मेटाबोलाइट का अभाव है पर चढ़ाया जाता है। कई आमतौर पर इस्तेमाल Saccharomyces cerevisiae प्रयोगशाला उपभेदों पहले से ही auxotrophic म्यूटेंट ³ वास्तव में कर रहे हैं। औद्योगिक, नैदानिक, और प्रोबायोटिक खमीर में तनाव, हालांकि, आम तौर पर सभी आवश्यक पोषक तत्वों के संश्लेषण के लिए क्षमता के साथ prototrophic हैं। ऐसे खमीर के अधिक कुशल आनुवंशिक हेरफेर सक्षम करने के लिए, auxotrophic जीन चुनिंदा लक्षित किया जा सकताउपभेदों कि एंटीबायोटिक दवाओं के बिना उत्पन्न करने के लिए चुना जा सकता है। ^{6 –} auxotrophic मार्कर जीन की विशिष्ट लक्ष्यीकरण पीसीआर की मध्यस्थता जीन व्यवधान CRISPR / Cas9 को निशाना बनाने से ⁴ मुताबिक़ पुनर्संयोजन या अधिक हाल ही में पर भरोसा कर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यूवी mutagenesis जल्दी खमीर उपभेदों कई plasmids के साथ जो परिवर्तन के लिए तकनीकी रूप से कठिन ⁷ में भी auxotrophic म्यूटेंट उत्पन्न कर सकते हैं। पीसीआर लक्ष्यीकरण और CRISPR / Cas9 बड़े पैमाने पर कहीं वर्णित किया गया है, भाग में प्रस्तुत इस पांडुलिपि की एक विस्तृत एक यूवी mutagenesis दृष्टिकोण auxotrophic उपभेदों कि खमीर transformants की सकारात्मक एंटीबायोटिक चयन के बजाय नकारात्मक चयन के लिए अनुमति देगा बनाने के लिए का वर्णन प्रोटोकॉल है।

heterologous प्रोटीन की मौखिक प्रसव के लिए इस तरह के auxotrophic उपभेदों के उपयोग में अगले आवश्यक कदम प्लास्मिड डीएनए के साथ खमीर परिवर्तन है। yeas का पहला सफल परिवर्तन के बादटी स्फेरोप्लास्ट 1,978 ⁸ में Saccharomyces cerevisiae के लिए सूचना दी, कई संशोधनों दक्षता बढ़ाने के लिए और कम करने खमीर प्रजातियों के साथ जो आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता करने के लिए विशेषता किया गया है। एस में डीएनए के सफल परिवर्तन के लिए electroporation का प्रयोग cerevisiae पहली बार 1985 ⁹ में वर्णित किया गया था और तब से osmotically समर्थन कोशिकाओं ¹⁰ 1 एम सोर्बिटोल ऊष्मायन के अलावा के माध्यम से सुधार किया गया है। Electroporation दक्षता इसके अलावा खमीर प्रजातियों और तनाव, सेल नंबर और विकास के चरण, electroporation मात्रा क्षेत्र की ताकत, और विशिष्ट बफ़र्स ¹¹ पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है। के रूप में यह कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है लिथियम एसीटेट (LiOAc) परिवर्तन, मूल इतो एट अल। ¹² से वर्णित है, सबसे अधिक इस्तेमाल परिवर्तन प्रोटोकॉल के बीच है। अतिरिक्त विश्लेषण से पता चला कि LiOAc खमीर परिवर्तन की क्षमता में काफी बढ़ जाती है जब कोशिकाओं मध्य लॉग चरण में एकत्र कर रहे हैंविकास की और गर्मी 42 डिग्री सेल्सियस ¹² में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और डीएनए की उपस्थिति में हैरान हैं। खूंटी के साथ पूरे बरकरार खमीर की ऊष्मायन संभवतः कोशिका झिल्ली के लिए डीएनए की कुर्की में सुधार के माध्यम के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली ¹³ पर अन्य प्रभाव के माध्यम से कुशल परिवर्तन के लिए आवश्यक है। लिथियम खुद भी बरकरार कोशिकाओं ¹⁴ की पारगम्यता बढ़ जाती है। हालांकि सबसे प्रयोगशाला एस cerevisiae उपभेदों आसानी से LiOAc परिवर्तन ³ का उपयोग तब्दील किया जा सकता है, अन्य प्रजातियों खमीर और अधिक कुशलता से वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग तब्दील किया जा सकता है। Pichia pastoris, उदाहरण के लिए, सबसे अधिक कुशलता से electroporation बजाय LiOAc परिवर्तन से ¹³ के माध्यम से बदल रहा है। यह महत्वपूर्ण है, इसलिए, कई परीक्षण करने के लिए परिवर्तन के तरीकों और जब करने के प्रयास में आनुवंशिक रूप से संशोधित एक uncharacterized खमीर तनाव ऊष्मायन अवधि और अभिकर्मक सांद्रता अनुकूलन करने के लिए। यह पांडुलिपि इस प्रकार दोनों LiOAc टीआर का वर्णनansformation और auxotrophic उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार एस के परिवर्तन के लिए तकनीक के रूप में electroporation boulardii। इच्छुक पाठकों खमीर परिवर्तन, वैकल्पिक प्रोटोकॉल, और कार्रवाई ^13,15 के संभावित तंत्र के आगे की चर्चा के विकास के लिए पूरी तरह से विवरण के लिए हाल ही में समीक्षा करने के लिए निर्देशित कर रहे हैं। प्लाज्मिड एक आसानी से पहचाने जा प्रोटीन एन्कोडिंग के साथ खमीर के परिवर्तन के लिए उचित अभिव्यक्ति और heterologous प्रोटीन के समारोह सुनिश्चित करने के लिए नीचे की ओर परीक्षण के लिए इसके अलावा आवश्यक है। असंख्य विभिन्न प्रोटीन चिकित्सीय अध्ययन का परम उद्देश्य और immunoblotting, एलिसा, और अन्य तकनीकों से एंटीबॉडी प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपलब्ध के आधार पर चुना जा सकता है। इन तकनीकों के लिए प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से अन्यत्र ^16,17 वर्णित किया गया है, और मानक घटता की तुलना द्वारा तब्दील खमीर से heterologous प्रोटीन के उत्पादन के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रदर्शन के और दिखाने के लिए प्रयोजनों के लिएखमीर जीव विज्ञान में एक बहुत अधिक इस्तेमाल किया प्रोटीन के सफल उत्पादन, इस पांडुलिपि प्लाज्मिड एन्कोडिंग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) है, जो बाद में पता लगाने के लिए अनुमति देता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग के साथ परिवर्तन प्रस्तुत करता है।

समान रूप से प्रोबायोटिक जीवों कि अभिव्यक्त भागों तीन और चार में वर्णित के रूप में heterologous प्रोटीन, उचित प्रशासन और जठरांत्र ऊतकों के भीतर इन सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। मौखिक gavage के माध्यम से पुनः संयोजक खमीर का प्रशासन सीधे पेट, जिसमें से C57BL / 6 चूहों स्वाभाविक रूप से ¹⁸ उल्टी के काबिल नहीं हैं में खमीर की नियंत्रित मात्रा के वितरण के लिए अनुमति देता है। हालांकि, अनुचित जानवर से निपटने और gavage esophageal नुकसान और वेध, गैस्ट्रिक वेध, सांस की नली प्रशासन, और आकांक्षा निमोनिया ^19,20 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। गरीब तकनीक और अनुभवहीनता इसके अलावा murine प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रयोगात्मक resu में परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैंएलटीएस, जो मौखिक gavage ^21,22 पर पशु तनाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। उचित तकनीक में अभ्यास इस प्रकार न केवल पशु असुविधा attenuate कर सकते हैं, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक परिणामों की शुद्धता को बढ़ा सकते हैं। इस पांडुलिपि का वर्णन करता है और पुनः संयोजक खमीर की नियंत्रित खुराक के प्रशासन के लिए जानवर से निपटने और मौखिक gavage को दर्शाता है।

अंत में, यह खमीर और heterologous प्रोटीन की उपस्थिति के लिए लसीकावत् ऊतकों का विश्लेषण करके पुनः संयोजक खमीर के सफल प्रसव पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। जठरांत्र प्रतिरक्षा ऊतकों जो सबसे अधिक आसानी से और जाहिर है खमीर की उपस्थिति के लिए जांच की जा सकती Peyer पैच रहे हैं। Peyer पैच कि श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरण ²³ के प्रमुख साइटों रहे हैं छोटी आंत के साथ माध्यमिक लसीकावत् अंग हैं। लुमेन से एंटीजन transcellularly microfold के माध्यम से (एम) उपकला कोशिकाओं में स्थानांतरित कर रहे हैं और Peyer पैच में जारी किया जाता है, इस प्रकार उजागर लगा देनाडी प्रतिजन कोशिकाओं पेश ल्यूमिनल सामग्री आंतों के लिए। हालांकि आंतों उपकला भर कण तेज भी जाम कोशिकाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, इन कोशिकाओं को केवल ऊपर ले कणों कम से कम व्यास ²⁴ में 0.02 माइक्रोन के लिए दिखाया गया है। Transepithelial डेन्ड्राइट CD103 ⁺ वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) भी ²⁵ लुमेन आंतों से छोटे कणों को लेने से बढ़ाया; हालांकि, वर्तमान में प्रदर्शित किया कि CD103 ⁺ डीसी बैक्टीरिया से बड़ा कणों को ले कोई रिपोर्ट कर रहे हैं। इस प्रकार, अक्षत प्रोबायोटिक खमीर, व्यास में 3-6 माइक्रोन के बीच औसत आकार के, सबसे एम कोशिकाओं द्वारा हाथ में लिया और Peyer पैच को हस्तांतरित करने की संभावना है। यहाँ वर्णित है, हालांकि इस प्रक्रिया को भी आसानी से प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के तेज के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, संग्रह और व्यवहार्य पुनः संयोजक खमीर के लिए Peyer पैच की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है।

सारांश में, के वितरण के लिए पुनः संयोजक प्रोबायोटिक खमीर का आकलनआंत के लिए rapeutic प्रोटीन जानवर से निपटने और इम्यूनोलॉजी के लिए आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में फैले तकनीक में दक्षता की आवश्यकता है। 1 के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं प्रोटोकॉल) पीढ़ी और auxotrophic खमीर उपभेदों की स्क्रीनिंग जो आसानी से नकारात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के बिना चुना जा सकता है, 2) वैकल्पिक प्रोटोकॉल खमीर बदलने और heterologous प्रोटीन की अभिव्यक्ति सक्षम करने के लिए, 3) उचित जानवर से निपटने के लिए तकनीक और मौखिक gavage के प्रदर्शनों पुनः संयोजक खमीर की intragastric वितरण, और Peyer पैच विच्छेदन के लिए 4) प्रोटोकॉल और व्यवहार्य पुनः संयोजक खमीर और कार्यात्मक heterologous प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग। संयुक्त, इन प्रोटोकॉल पीढ़ी और एक प्रोबायोटिक खमीर जठरांत्र संबंधी मार्ग को heterologous चिकित्सीय प्रोटीन देने में सक्षम तनाव के परीक्षण के लिए अनुमति देगा।

Protocol

1. यूवी mutagenesis Auxotrophic खमीर उपभेदों उत्पन्न करने के लिए पराबैंगनी विकिरण खुराक की जरूरत निर्धारित करने के लिए अस्तित्व घटता उत्पन्न मानक प्रक्रियाओं के अनुसार 26 YPD (खमीर निकालने peptone डेक्सट्रोज) मी?…

Representative Results

एक अस्तित्व वक्र पराबैंगनी विकिरण के बाद की पीढ़ी पतला खमीर कोशिकाओं है कि इस तरह अलग कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के रूप में करने में सक्षम हैं के चढ़ाना की आवश्यकता है। प्रत्येक 500 μl नमूने के र?…

Discussion

साथ में, प्रोटोकॉल के साथ साथ आंत के लिए heterologous चिकित्सीय प्रोटीन की डिलीवरी के लिए विकास और auxotrophic प्रोबायोटिक खमीर उपभेदों के परीक्षण के लिए आवश्यक चरण का वर्णन है। इस हेरफेर और पुनः संयोजक प्रोबायोटिक ?…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053