Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma
Summary
Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.
Abstract
Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.
Introduction
Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar etkili ve ekonomik gastrointestinal heterolog proteinlerin teslim ilginç bir potansiyel araçlardır. Bu organizmalar, henüz 1 kolonize olmayan sindirim kanalından geçişini kalan kontrollü doz sağlayan ve uyuşturucu dile maruz kalma sınırlama yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, kolay büyük ölçekte heterolog protein üretmek için bu organizmaların mühendislik becerisi olanağına sentetik dağıtım parçacıkları ekonomik bir alternatif oluşturur. En son 2 boulardii'nin probiyotik maya Saccharomyces Okzotrofik suşu kullanılarak ortaya Ancak, böyle bir yaklaşım geliştirilmesi, maya ve moleküler biyoloji hayvanlara yönelik teknikler ve immünolojik yöntemler kadar geleneksel olarak, belirli bir çalışma içinde birleştirilmemiş laboratuvar teknikleri, bilgi gerektirir. Burada tarif edilen bireysel işlemler kendilerini yeni değildir Böylece rağmenLaboratuar protokolleri, bu yazının amacı sıçangil gastrointestinal ilaç verme araçları olarak probiyotik maya deneysel test için gerekli tekniklere birleşik giriş sunmaktır. Sağlanan için gerekli protokollerin bir derleme: kolayca genetik manipüle edilebilir maya auxotrophic mutant suşlar 1) nesil; maya kültürlerinin 2) dönüşümü, heterolog proteini ifade etmek üzere; oral gavaj yoluyla bağırsak rekombinant maya 3) uygulama; onların heterolog protein ifade kemirgen bağırsak ve değerlendirme gelen canlı rekombinant probiyotik maya ve 4) kurtarma.
Çok sayıda pozitif ve negatif seçim yöntemleri maya türleri manipülasyonu için mevcut olmakla beraber İlk olarak, bu tür Okzotrofik işaretleyiciler kullanılarak negatif seçim etkinliği ve maya dönüştürülmüş ve seçilebilir kolaylığına artırmaktadır. co antibiyotik kullanan transformantların pozitif seçimi,ntrast önemli ölçüde maya manipülasyon maliyetini arttırır. Ayrıca, antibiyotik içeren katı ortam üzerinde maya seçimi üzerinden sentetik damla katı ortam (yayınlanmamış gözlemler) hakkında oksotropik maya seçimine göre dönüştürülmemiş arka kolonilerin artan büyümesi için izin verir. Okzotrofik maya temel amino asitler ya da urasil sentezi için önemli enzimler eksikliği olan suşlarıdır. maya temel metaboliti yoksun medya üzerinden sentetik damla üzerine kaplama olduğunda böylece negatif seçim sağlayarak, eksik metaboliti veya metabolik geni ile takviye Böyle maya sadece büyüyebilir. Bir çok yaygın olarak kullanılan Saccharomyces cerevisiae laboratuar soyları önce aslında oksotropik mutantları 3 bulunmaktadır. Endüstriyel, klinik ve probiyotik maya suşları, ancak, tipik olarak tüm gerekli besinleri sentez yeteneği ile prototropik bulunmaktadır. Bu tür maya daha etkili genetik olarak işlenmesine olanak sağlamak için, oksotrofik genler seçici hedeflenebilirantibiyotiksiz seçilebilir suşlarını meydana getirmek üzere. 6 – okzotrofik işaretleyici gen spesifik hedefleme CRISPR / Cas9 4 hedefleme ile daha yakın homolog rekombinasyon veya dayanarak PCR aracılı gen bozulması ile elde edilebilir. Alternatif olarak, UV mutagenez hızla hatta 7 teknik olarak zordur birden fazla plazmid ile hangi dönüşüm için maya suşları auxotrophic mutantlar üretebilir. PCR hedefleme ve CRISPR / Cas9 başka yerlerde tarif edilmiş olmakla beraber, bu yazının bir negatif seçim yerine Maya transformantlarının pozitif antibiyotik seçimi için sağlayacak oksotropik türleri oluşturmak için, UV mutagenez yaklaşımı anlatan detaylı bir protokoldür bölümünde sunulmuştur.
Heterolog bir proteinin oral yoldan uygulanması için böyle bir oksotrofik suşların kullanımı aşağıdaki gerekli bir aşama plazmid DNA ile maya dönüşümdür. evetler ilk başarılı dönüşümü yana1978 8 Saccharomyces cerevisiae için bildirilen t sferoplastlar, çok sayıda değişiklik verimliliğini artırmak ve maya genetik olarak modifiye edilebilir kolaylığına karakterize edilmiştir. S. DNA'nın başarılı transformasyonu için elektroporasyon kullanımı cerevisiae 1985 9'da tarif edilmiştir ve o zamandan beri ozmotik destek hücreleri 10-1 M sorbitol kuluçkalama eklenerek geliştirilmiştir. Elektroporasyon verimi, ayrıca maya türleri ve şekil, hücre sayısı ve büyüme fazı elektroporasyon hacmi, alan şiddeti, ve spesifik tamponlar 11 bağlıdır gösterilmiştir. Özel bir ekipman gerektirir esas olarak Ito ve ark., 12 tarafından tarif edilen lityum asetat (LiOAc) dönüşümü, en yaygın olarak kullanılan transformasyon protokolleri arasında yer almaktadır. İlave analizler, hücreler mid-log fazında toplandığı zaman LiOAc maya dönüşüm verimliliği büyük ölçüde arttırdığını göstermiştirbüyüme ve ısı 42 ° C ve 12 polietilen glikol (PEG) ve DNA'nın mevcudiyetinde şok. PEG ile bütün dokunulmamış maya inkübasyonu muhtemelen hücre membranına DNA eki geliştirerek ve zar 13 diğer etkileri ile, etkin bir dönüşüm için gereklidir. Lityum kendisi de sağlam hücreler 14 geçirgenliğini arttırır. En laboratuvar S. rağmen cerevisiae suşları kolay LiOAc dönüşüm 3 kullanılarak transforme edilebilir, diğer maya türleri daha etkili bir şekilde bir alternatif protokoller kullanılarak transforme edilebilir. Pichia pastoris, örneğin, en verimli şekilde dönüştürülmüş yerine LiOAc dönüşüm 13 kıyasla- elektroporasyon üzerinden gerçekleştirilir. Bu önemlidir, bu nedenle, çok sayıda test genetik bir uncharacterized maya suşu değiştirmeye çalışırken ve dönüşüm yöntemleri kuluçka dönemleri ve reaktif konsantrasyonları optimize etmek. Bu el yazması, böylece LiOAc tr hem açıklaroksotropik mutan ve vahşi tipli S. transformasyonu için teknikleri ansformation ve elektroporasyon boulardii. İlgilenen okuyucular maya dönüşüm, alternatif protokoller ve eylem 13,15 olası mekanizmaların daha tartışmaların evrim kapsamlı açıklamaları için son değerlendirme yönlendirilir. Plazmid kolaylıkla fark edilebilir bir proteini kodlayan maya transformasyonu uygun bir ifade ile heterolog protein işlevini sağlamak üzere alt test için, ayrıca gereklidir. Sayısız farklı proteinler terapötik çalışma nihai amaç ve immunoblotting, ELISA ve diğer teknikler ile protein tespiti için kullanılabilir antikorlar olarak seçilebilir. Bu teknikler için protokoller iyice başka 16,17 tarif edilmiştir, ve standart eğri ile karşılaştırma ile dönüştürülmüş maya heterolog protein üretimi seviyesini tespit etmek için kullanılabilir. amaçlarla gösteri ve göstermek içinMaya biyolojide çok yaygın olarak kullanılan protein başarılı üretim bu Eser floresan mikroskobu kullanılarak takip eden şekilde tespit eder plazmid kodlayan yeşil floresan proteini (GFP) ile dönüşüm gösterir.
Üçüncü ve dördüncü de tarif edildiği gibi bir heterolog protein, uygun bir şekilde yönetilmesini ve gastrointestinal dokularda bu mikroorganizmaların tespit edilmesi, ifade probiyotik organizmalar üretimine kadar önemli bir. Oral gavaj yoluyla rekombinant maya uygulanması doğrudan C57BL / 6 fareleri, doğal olarak 18 kusma aciz olan mide içine maya kontrollü miktarların verilmesi için izin verir. Ancak, yanlış bir hayvan taşıma ve sonda özofagus hasarı ve perforasyon, mide delinmesi, trakea idaresi ve aspirasyon pnömonisi 19,20 yol açabilir. Kötü tekniği ve deneyimsizliği ayrıca fare bağışıklık tepkilerinin ve deneysel resu değişkenliği artırabiliroral sonda 21,22 üzerine hayvan strese atfedilen lt. Uygun teknikle Uygulama böylece sadece hayvan rahatsızlık zayıflatabilir, ama aynı zamanda deneysel sonuçların doğruluğunu artırabilir. Bu yazıda tarif ve rekombinant maya kontrollü dozlarda tatbikat için hayvanlara yönelik ve bir mide sondası gösterir.
Son olarak, maya ve heterolog proteinin varlığı için lenfoid dokular analiz ederek yeniden birleştirici maya başarılı bir şekilde iletilmesini teyit etmek için hayati önem taşımaktadır. En kolay ve tahmin maya varlığı için incelenebilir mide-immün doku Peyer yamaları. Peyer yamaları mukozal immün yanıt indüksiyon 23 anahtar siteleri ince bağırsakta boyunca ikincil lenfoid organlardır. lümenden antijenler microfold yoluyla transcellularly epitelde (M) hücre aktarılır ve içine maruz bırakılması ve böylece, Peyer yamaları salınırsunan hücrelerin D antijen lümen içeriği intestinal. Bağırsak epiteli üzerinde parçacık alımı da goblet hücreleri tarafından elde edilebilir, ancak bu hücrelerin yalnızca sürebilir parçacıkların çapı 24 daha az 0.02 um gösterilmiştir. Transepithelial dendritler CD103 + dendritik hücrelerin (DC) de 25 lümen intestinal küçük parçacıkları almak uzanan; Ancak, CD103 + DC'ler bakteri daha büyük parçacıkları sürebilir gösteren herhangi bir rapor bulunamamıştır. Böylece bütün probiyotik maya, çapı 3-6 mm arasında ortalama boyutu, E hücreleri tarafından alınır ve Peyer yamaları aktarılacak muhtemeldir. Burada tarif edilen bu prosedür, aynı zamanda kolayca probiyotik bakteri alımını değerlendirmek için adapte edilebilir, ancak, toplama ve uygun bir yeniden birleştirici maya için Peyer yamaları elenmesi için bir protokoldür.
Özet olarak, verilmesi için rekombinant probiyotik maya değerlendirmekbağırsak tetkik, tedavi proteinler, hayvan taşıma ve immünoloji moleküler biyoloji kapsayan laboratuvar teknikleri ustalığı gerektirir. 1 burada sunulmuştur protokolleri) kolay olumsuz antibiyotiksiz seçilebilir üretimi ve oksotropik maya suşunun taranması, 2), alternatif protokoller maya dönüşümü ve heterolog protein ekspresyonunu sağlamak için, 3), uygun hayvansal işleme teknikleri ve oral gavaj gösteriler rekombinant maya mide teslimat ve Peyer diseksiyon için 4) protokolleri ve yaşayabilir rekombinant maya ve fonksiyonel heterolog protein için tarama. Birlikte, bu protokoller üretimi ve mide bağırsak heterolog terapötik proteini sunma yeteneğine sahip bir probiyotik maya suşunun denemeden geçirilmesine izin verecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birlikte, protokoller burada bağırsak heterolog terapötik protein teslimat için geliştirilmesi ve okzotrofik probiyotik maya suşları testi için gerekli temel adımları açıklar. Bu manipülasyon ve rekombinant probiyotik maya testi herhangi bir bireysel laboratuvar şu anda aşina olmayabilir hangi ile teknikleri ve kaynakları gerektirir. Çok sayıda daha önceki çalışmalar çok maya fare türü için de, yukarıda protokolleri açıklanmasına rağmen Böylece, bu yöntemler, yazarların bilgisi detaylı…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Tracey J. Lamb verilen İmmünoloji ve Aşılar ve NIH Yeni Yenilikçisi Ödülü (1DP2AI112242-01) için Çocuk Merkezi aracılığıyla finansman kabul. Yazarlar ayrıca rad1 S. cömert katkılarından dolayı Natalya P. Degtyareva teşekkür cerevisiae.
Materials
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | BioRad | 170-2501 | Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures |
| New Brunswick Roller Drum | Eppendorf | M1053-4004 | Example of roller drum for yeast culture incubation |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Example stratalinker |
| Stuart Colony Counter SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen |
| Scienceware Colony Counter | F378620002 | Bel-Art Scienceware | Hand held colony counter pen |
| Replica plating device | Fisherbrand | 09-718-1 | Example of replica plating stand and pads |
| Velveteen squares | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| L shaped sterile cell spreaders | Fisherbrand | 14665230 | |
| Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation |
| Gavage needles | Braintree Scientific | N-PK 002 | For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used |
| 1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps | Electron Microscopy Sciences | 77937-28 | Example of blunt forceps needed for dissection |
| Straight and curved dissection scissors | Electron Microscopy Sciences | 72966-02 and 72966-03 | Examples of scissors needed for dissection |
| IMDM | Life technologies | 12440053 |
References
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , (1991).
- DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
- Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
- Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
- Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
- Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
- Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -. M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
- Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
- Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
- JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
- Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can’t Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
- Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
- Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
- Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
- Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
- McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
- Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. . Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).
- Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5′-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
- Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Génétique. 93, 51-65 (1979).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson, ., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), 553-560 (2000).
- Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Génétique. 81, 75-97 (1975).
- Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
- McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
- Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
- Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
- Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
- Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer’s patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
- Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).
