Omvandling av probiotiska Jäst och deras återhämtning från Gastrointestinal Immune Vävnader Efter oral sondmatning hos möss

Summary

Som presenteras här är en enhetlig beskrivning av tekniker som kan användas för att utveckla, omvandla, administrera, och testa heterologt protein uttryck av de probiotiska jästen Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Probiotiska mikroorganismer är en spännande potentiella medel för effektivt och ekonomiskt att leverera heterologa proteiner till mag-tarmkanalen. Dessa organismer är kapabla att överleva passagen genom mag-tarmkanalen ännu inte kolonisera det ^en som möjliggör kontrollerad dosering och begränsa exponering för läkemedlet uttryckt. Dessutom möjlighet att enkelt konstruera dessa organismer för att producera heterologt protein i stor skala gör dem ett ekonomiskt alternativ till syntetiska leveranspartiklar. Men utvecklingen av en sådan strategi, som nyligen visat med hjälp av en auxotrof stam av probiotiska jästen Saccharomyces boulardii ^2, kräver kunskap om laboratorietekniker inte traditionellt kombineras inom en given studie, från jäst och molekylärbiologi till djurhantering tekniker och immunologiska metoder. Således även om de enskilda förfaranden som beskrivs häri är inte i sig romanlaboratorieprotokoll, är målet för detta manuskript att presentera en enhetlig introduktion till tekniker som behövs för experimentell testning av probiotiska jäst som läkemedelsleveransfordon till den murina mag-tarmkanalen. Förutsatt är en sammanställning av viktiga protokoll för: 1) generering av auxotrofa mutantjäststammar som lätt kan genmanipulerade; 2) transformation av jästkulturer för att uttrycka heterologt protein; 3) administrering av rekombinant jäst till tarmen via oral sondmatning; och 4) återvinning av livskraftiga rekombinant probiotiska jäst från mus tarm och bedömning av deras heterologt proteinuttryck.

Först, även om många positiva och negativa urvalsmetoder finns för manipulering av jästarter, ökar negativ selektering, såsom genom användning av auxotrofa markörer både effektivitet och lätthet med vilken jäst kan transformeras och väljas. Positiv selektering av transformanter med användning av antibiotika, i samarbetentrast, signifikant ökar kostnaden för jäst manipulation. Dessutom kan valet av jäst på antibiotikainnehållande fasta medier möjliggör ökad tillväxt av otransformerade bakgrundskolonier i förhållande till val av auxotrof jäst på syntetiskt avhoppen fasta medier (opublicerade observationer). Auxotrofa jäst är stammar som saknar enzymer kritiska för syntes av essentiella aminosyror eller uracil. En sådan jäst kan växa endast om kompletteras med den saknade metabolit eller metabolisk gen, så att negativa val när jäst ströks ut på syntetisk hoppar media som saknar den väsentliga metaboliten. Många vanliga Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammar är i själva verket redan auxotrofa mutanter ^3. Industrial, klinisk och probiotiska jäststammar är emellertid typiskt prot med förmågan att syntetisera alla nödvändiga näringsämnen. För att möjliggöra en effektivare genetisk manipulation av sådan jäst kan auxotrofa gener selektivt riktadeatt generera stammar som kan väljas utan antibiotika. Särskild inriktning på auxotrofa markörgener kan uppnås genom PCR-medierad gen störningar förlitar sig på homolog rekombination eller mer nyligen genom crispr / Cas9 inriktning ^4-6. Alternativt kan UV-mutagenes snabbt generera auxotrofa mutanter även i jäststammar som transformation med flera plasmider är tekniskt svårt ^7. Medan PCR inriktning och crispr / Cas9 har beskrivits utförligt på annat håll, som presenteras i del ett av detta manuskript är ett detaljerat protokoll som beskriver en UV-mutagenes strategi för att skapa auxotrofa stammar som gör det möjligt för negativt urval snarare än positiv antibiotikaselektion av jästtransformanter.

Nästa nödvändigt steg vid användningen av sådana auxotrofa stammar för oral tillförsel av heterologt protein är jäst transformation med plasmid-DNA. Sedan den första framgångsrika omvandlingen av yeast sfäroplaster rapporterats för Saccharomyces cerevisiae 1978 ^8, har ett flertal modifieringar präglats för att öka effektiviteten och lätthet med vilken jästarter kan vara genetiskt modifierade. Användning av elektroporering för en framgångsrik omvandling av DNA i S. cerevisiae beskrevs första gången 1985 ⁹ och har sedan dess förbättrats genom tillsats av 1 M sorbitol inkubation till osmotiskt stödceller ^10. Elektroporering effektivitet har dessutom visat sig bero på jäst art och stam, antalet celler och tillväxtfas, elektroporering volym, fältstyrka, och specifika buffertar ^11. Litiumacetat (LiOAc) transformation, ursprungligen beskrevs av et al. Ito ^12, är bland de mest använda transformationsprotokoll eftersom det kräver ingen speciell utrustning. Ytterligare analyser visade att effektiviteten hos LiOAc jästtransformation ökar i hög grad när cellerna samlas i mitten av log-fasenav tillväxt och är värmechock i närvaro av polyetylenglykol (PEG) och DNA vid 42 ° C ^12. Inkubation av hela intakt jäst med PEG är väsentlig för effektiv omvandling, eventuellt genom att förbättra fastsättning av DNA till cellmembranet samt via andra effekter på membranet ^13. Litium självt ökar också permeabiliteten för intakta celler ^14. Även om de flesta laboratorium S. cerevisiae stammar kan lätt omvandlas med hjälp av LiOAc transformation ^3, kan andra jästarter vara mer effektivt transformeras med användning av alternativa protokoll. Pichia pastoris, till exempel, är mest effektivt omvandlas via elektroporering snarare än LiOAc omvandling ^13. Det är viktigt, därför att testa flera metoder för omvandling och att optimera inkubationsperioder och reagenskoncentrationer vid försök att genetiskt modifiera en karaktäriserad jäststam. Detta manuskript beskriver således både LiOAc transformation och elektroporering som teknik för omvandling av auxotrof mutant och vild typ S. boulardii. Intresserade läsare är inriktade på senaste recensioner för noggranna beskrivningar av utvecklingen av jäst omvandling, alternativa protokoll, och ytterligare diskussioner om möjliga verkningsmekanismer ^13,15. Transformation av jäst med plasmid som kodar för ett lätt detekterbart protein är dessutom en förutsättning för efterföljande tester för att säkerställa korrekt uttryck och funktion av heterologt protein. Otaliga olika proteiner kan väljas beroende på det yttersta syftet med den terapeutiska studien och antikropparna som proteindetektion av immunoblotting, ELISA, och andra tekniker. Protokoll för dessa tekniker har grundligt beskrivits på annat ställe ^16,17, och kan användas för att bestämma nivåer av heterolog proteinproduktion från transformerad jäst genom jämförelse med standardkurvor. För syftena med demonstration och att visaframgångsrik produktion av ett mycket vanligt förekommande protein i jäst biologi, presenterar detta manuskript transformation med plasmid kodande grönt fluorescerande protein (GFP), som gör det möjligt för efterföljande detektion med användning av fluorescensmikroskopi.

Lika viktigt för produktion av probiotiska organismer som uttrycker heterologt protein är det en god förvaltning och detektering av dessa mikroorganismer inom gastrointestinala vävnader, som beskrivs i delar tre och fyra. Administrering av rekombinant jäst via oral sondmatning möjliggör avgivning av kontrollerade kvantiteter av jäst direkt in i magen, från vilket C57BL / 6-möss är naturligt oförmögna att kräkningar ^18. Däremot kan felaktig djurhantering och sondmatning leda till matstrupen skada och perforering, gastrisk perforering, luftrör administration, och aspirationspneumoni ^19,20. Dålig teknik och bristande erfarenhet kan vidare öka variabiliteten i murina immunsvar och experimentell Results, som har tillskrivits djur stressen vid oral sondmatning ^21,22. Praxis i korrekt teknik kan således inte endast dämpa djuret obehag, men kan också öka precisionen av experimentella resultat. Detta manuskript beskriver och visar förvaltning av kontrollerade doser av rekombinant jäst djurhantering och oral sondmatning.

Slutligen är det viktigt att bekräfta framgångsrik leverans av rekombinant jäst genom att analysera lymfoidvävnader avseende på närvaro av jäst och heterologa proteinet. Mag immun vävnader som undersökts kan enklast och förutsägbart vara med avseende på förekomst av jäst är de Peyerska placken. Peyers plack är sekundära lymfoida organ längs tunntarmen som är viktiga områden av mukosal immunsvarsinduktion ^23. Antigener från lumen överförs transcellularly genom microfold (M) celler i epitelet och frigörs i de Peyerska placken och exponerar därmed omslutad antigenpresenterande celler till tarm luminala innehåll. Även om partikelupptag över tarmepitelet också kan uppnås genom bägarceller, har dessa celler visats endast tar upp partiklar mindre än 0,02 pm i diameter ^24. Transepitelialt dendriter sträckte sig från CD103 ⁺ dendritiska celler (DC) också tar upp små partiklar från tarmlumen ^25; men det finns för närvarande inga rapporter som visar att CD103 ⁺ DCs ta upp partiklar som är större än bakterier. Således intakt probiotiska jäst, av medelstorlek mellan 3-6 mikrometer i diameter, är mest sannolikt att tas upp av M-celler och överfördes till de Peyerska placken. Som beskrivs här är ett protokoll för insamling och screening av Peyers plack för livsduglig rekombinant jäst, även om detta förfarande också lätt kan anpassas för att utvärdera upptag av probiotiska bakterier.

Sammanfattningsvis bedömer rekombinant probiotiska jäst för leverans avrapeutic proteiner till tarmen kräver kunskaper i laboratorietekniker som spänner över molekylärbiologi till djurhantering och immunologi. Presenteras här är protokoll för en) generering och screening av auxotrofa jäststammar som kan lätt negativt väljas utan antibiotika, 2) alternativa protokoll för att transformera jäst och möjliggöra expression av heterologt protein, 3) demonstrationer av lämpliga djurhantering teknik och oral sondmatning för intragastrisk tillförsel av rekombinant jäst, och 4) protokoll för Peyers plack dissektion och screening för livsduglig rekombinant jäst och funktionellt heterologt protein. Tillsammans kommer dessa protokoll möjliggör generering och provning av en probiotisk jäststam som kan leverera heterologa terapeutiskt protein till mag-tarmkanalen.

Protocol

1. UV-mutagenes för att generera auxotrof jäststammar Generera överlevnadskurvor för att bestämma korrekt dos av UV-bestrålning Förbered YPD (jästextrakt pepton dextros) media och andra reagens som anges i tabell 1 enligt standardprocedurer 26 och ympa enskilda kolonier i 5-10 ml YPD medium. Inkubera kulturer på en rulltrumma vid 30 ° CO / N till mättnad under minst åtta timmar. Bestämma cellkoncentration av O / N odlingar med använ…

Representative Results

Generering av en överlevnadskurva efter UV-bestrålning kräver plätering av utspädda jästceller så att olika kolonibildande enheter (CFU) kan bilda. Varje prov 500 | il samlas upp såsom beskrivits ovan innehåller cirka 5 x 10 6 celler; Men större än 100 kolonier per platta är svårt att exakt urskilja. Bordläggningen outspätt prov samt serie 1:10 utspädningar av bestrålade celler garanterar därmed att CFU kan räknas upp vid varje UV-dos, som visas</str…

Discussion

Tillsammans protokollen häri beskriver de väsentliga åtgärder som är nödvändiga för utveckling och testning av auxotrofa probiotiska jäststammar för leverans av heterologt terapeutiskt protein till tarmen. Denna manipulation och testning av rekombinant probiotiska jästen kräver metoder och resurser som ett enskilt laboratorium för närvarande inte kan vara bekant. Sålunda, även om ett stort antal tidigare studier har beskrivit de ovanstående protokoll för multipla jäst och musstammar, dessa metoder har…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053