Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

Summary

Hier voorgesteld is een enkelvoudige beschrijving van technieken die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen, veranderen, beheren en testen heterologe eiwitexpressie van de probiotische gist Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Probiotische micro- organismen een intrigerende potentieel middel efficiënt en economisch afleveren heterologe eiwitten aan het maagdarmkanaal. Deze organismen kunnen overleven passage door het maagdarmkanaal nog niet koloniseren ^1, waardoor geregelde dosering en beperken van de blootstelling aan het geneesmiddel expressie. Bovendien de mogelijkheid om eenvoudig manipuleren deze organismen heterologe eiwit op grote schaal maakt ze een voordelig alternatief voor synthetische levering deeltjes. Echter, de ontwikkeling van een dergelijke benadering, zoals onlangs aangetoond met een auxotrofe stam van het probiotische gist Saccharomyces boulardii ^2, vereist kennis van laboratoriumtechnieken gewoonlijk niet gecombineerd tot een bepaald onderzoek, van gist en moleculaire biologie dier behandelingstechnieken en immunologische werkwijzen. Hoewel dus de hierin beschreven afzonderlijke procedures op zichzelf niet nieuwlaboratoriumprotocollen het doel van dit manuscript is om een ​​uniforme inleiding technieken die nodig zijn voor experimentele testen van probiotische gist geneesmiddelafgiftedragers met het muize maagdarmkanaal aanwezig. Verschaft wordt een compilatie van essentiële protocollen: 1) productie van auxotrofe mutante giststammen die gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd; 2) transformatie van gist culturen heteroloog eiwit tot expressie brengen; 3) toediening van recombinant gist de darm via orale gavage; en 4) het herstel van levensvatbare recombinant probiotische gist uit de muizen darm en beoordeling van hun heterologe eiwitexpressie.

Eerst, hoewel talrijke positieve en negatieve selectie methoden bestaan ​​voor het manipuleren van gistsoorten, negatieve selectie bijvoorbeeld door het gebruik van auxotrofe merkers verhoogt de efficiëntie en het gemak waarmee gist kan worden getransformeerd en geselecteerd. Positieve selectie van transformanten het gebruik van antibiotica, in samenwerkingntrast, verhoogt de kosten van gist manipulatie. Bovendien kan selectie van gist op antibiotica bevattende vaste media zorgen voor meer groei van getransformeerde achtergrond kolonies ten opzichte van selectie van auxotrofe gist over synthetische drop-out vaste media (niet gepubliceerde waarnemingen). Auxotrofe gist stammen die enzymen die kritisch zijn voor de synthese van essentiële aminozuren of uracil ontbreekt. Dergelijke gist kan alleen groeien als aangevuld met de ontbrekende metaboliet of metabole gen, waardoor negatieve selectie wanneer gist wordt uitgeplaat op synthetische drop-out media dat de essentiële metaboliet ontbreekt. Veel veelgebruikte Saccharomyces cerevisiae laboratoriumstammen zijn in feite al auxotrofe mutanten ^3. Industriële, klinische en probiotische giststammen zijn echter meestal prototrofe met de mogelijkheid om alle benodigde voedingsstoffen synthetiseren. Efficiëntere genetische manipulatie van dergelijke gist mogelijk te maken, kunnen auxotrofe genen selectief worden gerichtstammen die kunnen worden geselecteerd zonder antibiotica te genereren. Specifiek richten auxotrofe merker genen kan worden bereikt door PCR gemedieerde genverstoring beroep op homologe recombinatie of recenter tot CRISPR / Cas9 targeting ^4-6. Als alternatief kunnen UV-mutagenese snel genereren auxotrofe mutanten zelfs in giststammen die transformatie met meerdere plasmiden is technisch moeilijk ^7. Terwijl PCR targeting en CRISPR / Cas9 zijn uitgebreid elders zijn beschreven, gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript is een gedetailleerd protocol beschrijft een UV-mutagenese benadering van auxotrofe stammen die zal zorgen voor negatieve selectie in plaats van positief antibiotische selectie van gist-transformanten te creëren.

De volgende noodzakelijke stap in het gebruik van dergelijke auxotrofe stammen voor orale afgifte van heteroloog eiwit gist transformatie met plasmide-DNA. Sinds de eerste succesvolle transformatie van yeast sferoplasten gerapporteerd voor Saccharomyces cerevisiae in 1978 ^8, zijn talrijke wijzigingen gekarakteriseerd om de efficiëntie en het gemak waarmee gistsoort genetisch kunnen worden gemodificeerd. Gebruik van elektroporatie voor de succesvolle transformatie van DNA in S. cerevisiae werd eerst beschreven in 1985 ⁹ en is sindsdien verbeterd via de toevoeging van 1 M sorbitol incubatie osmotisch steuncellen ^10. Electroporatie efficiency is bovendien aangetoond dat afhangen van de gistsoort en stam celaantal en groeifase, elektroporatie volume, veldsterkte en specifieke buffers ^11. Lithiumacetaat (LiOAc) transformatie, oorspronkelijk beschreven door Ito et al. ^12, is een van de meest gebruikte transformatie protocollen zoals vereist geen speciale apparatuur. Aanvullende analyses toonden aan dat de efficiëntie van LiOAc gist transformatie verhoogt wanneer cellen worden verzameld in mid-log-fasegroei en worden warmteschok in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG) en DNA bij 42 ° C ^12. Incubatie van intacte gist geheel met PEG is essentieel voor efficiënte transformatie, mogelijk door verbetering bevestiging van DNA aan het celmembraan en via andere effecten op het membraan ^13. Lithium zelf verhoogt ook de permeabiliteit van intacte cellen ^14. Hoewel de meeste laboratorium S. cerevisiae stammen kunnen gemakkelijk worden omgezet middels LiOAc transformatie ^3, kunnen andere gistsoorten efficiënter omgezet alternatieve protocollen. Pichia pastoris, bijvoorbeeld, is het meest efficiënt omgezet via elektroporatie plaats LiOAc transformatie ^13. Het is cruciaal derhalve testen meerdere methoden voor transformatie en incubatieperiode en reagens concentraties te optimaliseren bij een poging om genetisch te modificeren een uncharacterized giststam. Dit manuscript beschrijft dus zowel LiOAc transformation en elektroporatie als technieken voor de transformatie van auxotrofe mutant en wildtype S. boulardii. Geïnteresseerde lezers zijn gericht op de recente beoordelingen voor een grondige beschrijving van de evolutie van gist transformatie, alternatieve protocollen, en de verdere discussies over mogelijke werkingsmechanismen ^13,15. Transformatie van gist met plasmide dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit ook van groot belang voor stroomafwaartse testen teneinde juiste expressie en functie van heteroloog eiwit te garanderen. Talloze verschillende eiwitten kunnen worden geselecteerd afhankelijk van het uiteindelijke doel van de therapeutische studie en de voor eiwit detectie antilichamen door immunoblotting, ELISA en andere technieken. Protocollen voor deze technieken zijn uitvoerig beschreven elders ^16,17 en kunnen worden gebruikt om niveaus van heterologe eiwitproductie uit getransformeerde gist te bepalen in vergelijking met standaard curves. Voor demonstratiedoeleinden en tonensuccesvolle productie van een zeer algemeen gebruikte eiwit in gist biologie, dit manuscript geeft transformatie met plasmide dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP), waardoor voor daaropvolgende detectie middels fluorescentiemicroscopie.

Even belangrijk voor de productie van probiotische organismen die tot expressie heteroloog eiwit goed beheer en detectie van deze micro-organismen in het maagdarmkanaal weefsels, zoals uiteengezet onder drie en vier. Toediening van recombinant gist via orale sondevoeding maakt afgifte van gecontroleerde hoeveelheden gist direct in de maag, waar C57BL / 6-muizen van nature niet in staat ¹⁸ braken. Echter, ongepaste dierlijke behandeling en sondevoeding leiden tot slokdarmkanker schade en perforatie, maagperforatie, tracheale administratie en aspiratiepneumonie ^19,20. Slechte techniek en onervarenheid kan verder toenemen variabiliteit in muizen immuunreacties en experimentele results, die zijn toegeschreven aan dierlijke nadruk op orale gavage ^21,22. Praktijk de juiste techniek kan derhalve niet alleen ongemak verminderen dier, maar ook precisie van experimentele resultaten verhogen. Dit manuscript beschrijft en demonstreert dierlijke behandeling en orale sondevoeding voor het beheer van gecontroleerde doses van recombinant gist.

Tenslotte is het essentieel om succesvolle uitvoering van recombinante gist bevestigd door analyse lymfoïde weefsels op de aanwezigheid van gist en heteroloog eiwit. Het maag immune weefsels die het gemakkelijkst en voorspelbaar voor de vinding onderzocht zijn de plaques van Peyer. Peyer's patches zijn secundaire lymfoide organen langs de dunne darm dat de belangrijkste bezienswaardigheden van mucosale immuunrespons inductie ²³ zijn. Antigenen uit de lumen worden overgedragen via transcellulair microfold (M) cellen in het epitheel en vrijkomen in de plaques van Peyer, aldus blootstellen omsluitend antigeenpresenterende cellen luminale inhoud intestinale. Hoewel deeltjes opname door de intestinale epitheel ook kan worden bereikt door slijmbekercellen werden deze cellen is aangetoond dat alleen van deeltjes kleiner dan 0,02 pm in diameter ^24. Transepithele dendrieten verlengd van CD103 ⁺ dendritische cellen (DC) ook van kleine deeltjes uit het darmlumen ^25; Er zijn echter nog geen rapporten die aantonen dat CD103 ⁺ DCs nemen deeltjes groter dan bacteriën. Aldus intact probiotische gist, van gemiddelde grootte tussen 3-6 pm in diameter, hoogstwaarschijnlijk door M-cellen worden genomen en overgedragen aan de plekken van Peyer. Hier beschreven is een protocol voor het verzamelen en screening van plaques van Peyer van levensvatbare recombinante gist, alhoewel deze procedure ook gemakkelijk kan worden aangepast voor de evaluatie opname van probiotische bacteriën.

Kortom, de beoordeling recombinante probiotische gist voor de levering van derapeutic eiwitten naar de darm vereist vaardigheid in laboratoriumtechnieken verspreid over de moleculaire biologie van dieren handling en immunologie. hier gepresenteerde zijn protocollen voor 1) het genereren en screenen van auxotrofe giststammen die gemakkelijk kan negatief zonder antibiotica worden geselecteerd, 2) alternatieve protocollen om gist te transformeren en in staat de expressie van heteroloog eiwit, 3) demonstraties van de juiste behandeling van dieren technieken en orale sondevoeding voor intragastrische levering van recombinante gist, en 4) protocollen voor Peyer's patch dissectie en screenen op levensvatbare recombinante gist en functioneel heterologe eiwitten. Samen zullen deze protocollen zorgen voor het genereren en testen van een probiotische giststam kan leveren heteroloog therapeutisch eiwit aan het maagdarmkanaal.

Protocol

1. UV Mutagenese aan auxotrofe giststammen genereren Genereer survival curves om de benodigde dosis UV-straling te bepalen Bereid YPD (gistextract pepton dextrose) media en andere reagentia in Tabel 1 opgesomde volgens standaardprocedures 26 en beënt enkele kolonies in 5-10 ml YPD-medium. Incubeer kweken op een roller trommel bij 30 ° CO / N tot verzadiging minstens 8 uur. Bepaal de celconcentratie van O / N culturen met een spectrofotometer cellen door verdunn…

Representative Results

Genereren van een overlevingscurve na UV bestraling vereist plating verdunde gistcellen zodat afzonderlijke kolonievormende eenheden (CFU) kunnen vormen. Elk 500 pl monster verzameld zoals hierboven beschreven bevat ongeveer 5 x 10 6 cellen; Echter, meer dan 100 kolonies per plaat zijn moeilijk om nauwkeurig te onderscheiden. Plating onverdund monster en seriële verdunningen van 1:10 bestraalde cellen dus zorgt ervoor dat CFU kunnen worden geteld op elke UV dosering, zoals aa…

Discussion

Samen vormen de protocollen beschrijven hierin de essentiële stappen die nodig zijn voor het ontwikkelen en testen van auxotrofe probiotische giststammen voor afgifte van heteroloog therapeutisch eiwit aan de darm. Deze manipulatie en het testen van recombinant probiotische gist vereist technieken en middelen waarmee een individu laboratorium kan op dit moment niet bekend zijn. Dus, hoewel talrijke eerdere studies de hierboven beschreven protocollen voor meerdere gist en muis stammen, deze methoden hebben niet om de ke…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053