Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Summary

Dargestellt ist hier die einheitliche Beschreibung von Techniken, die verwendet werden können, zu entwickeln, transformieren, zu verwalten und zu testen, die heterologe Proteinexpression der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Probiotische Mikroorganismen sind eine interessante Potential mittels effizient und wirtschaftlich heterologer Proteine ​​an den Gastrointestinaltrakt zu liefern. Diese Organismen sind in der Lage Passage durch den Magen-Darm-Trakt zu überleben noch nicht kolonisieren es nicht ^ein, so dass kontrollierte Dosierung und Reduzierung der Belastung durch das Medikament zum Ausdruck gebracht. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, leicht, diese Organismen Ingenieur heterologen Proteins in großem Maßstab zu produzieren macht sie eine kostengünstige Alternative zu synthetischen Lieferung Partikel. Jedoch Entwicklung eines solchen Konzepts, wie kürzlich einen auxotrophen Stamm der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii ² gezeigt, verwenden, erfordert die Kenntnis von Labortechniken traditionell nicht innerhalb einer gegebenen Studie kombiniert, die von Hefen und Molekularbiologie Tierhandhabungstechniken und immunologische Verfahren. Obwohl also die sind beschrieben einzelnen Verfahren hier nicht in sich RomanLaborprotokolle ist das Ziel dieses Manuskripts eine einheitliche Einführung in Techniken zur experimentellen Erprobung probiotischer Hefen als Arzneimittelabgabevehikel zur murine Gastrointestinaltrakt erforderlich zu präsentieren. Vorausgesetzt ist eine Zusammenstellung der wesentlichen Protokolle für: 1) Erzeugung von auxotrophen Mutantenstämmen der Hefe, die leicht genetisch manipuliert werden kann; 2) Transformation von Hefe Kulturen zu exprimieren heterologes Protein; 3) Verabreichung von rekombinanten Hefe in den Darm durch orale Sondenfütterung; und 4) Wiederherstellung lebensfähiger rekombinanten probiotischen Hefe aus dem murinen Darm und die Bewertung ihrer heterologen Proteinexpression.

Erstens, obwohl zahlreiche positive und negative Selektionsverfahren für die Manipulation von Hefe-Spezies vorhanden sind, negative Selektion, wie durch die Verwendung von auxotrophen Markern erhöht sowohl die Effizienz und Leichtigkeit, mit der Hefe kann transformiert und selektiert werden. Positive Selektion von Transformanten Antibiotika, in Zusammenarbeit mitntrast, erhöht die Kosten für die Hefe-Manipulation. Weiterhin Auswahl von Hefe auf antibiotikahaltigen festen Medien können für erhöhtes Wachstum von nicht-transformierten Hintergrund Kolonien in Bezug auf Auswahl von auxotrophen Hefe auf synthetischen Tropfen aus festen Medien (unveröffentlichte Beobachtungen) ermöglichen. Auxotrophen Hefe-Stämme, die Enzyme von entscheidender Bedeutung für die Synthese von essentiellen Aminosäuren oder Uracil fehlt. Solche Hefen können nur mit dem fehlenden Metaboliten oder Stoffwechselgens, so dass, wenn negative Selektion ergänzt wachsen, wenn Hefe auf synthetischen Tropfen aus Medien plattiert ist, die die essentiellen Metaboliten fehlt. Viele häufig verwendete Saccharomyces cerevisiae Laborstämme sind in der Tat bereits auxotrophen Mutanten ^3. Industriellen, klinischen und probiotischen Hefestämme sind jedoch üblicherweise prototroph mit der Fähigkeit, alle erforderlichen Nährstoffe zu synthetisieren. So aktivieren effizienter genetische Manipulation solcher Hefe kann auxotrophen Gene ganz gezieltzu erzeugen, die ohne Antibiotika Stämme ausgewählt werden können. Spezifisches Targeting von auxotrophen Markergene können durch PCR-vermittelte Gen-Unterbrechung erreicht werden über eine homologe Rekombination zu verlassen oder in jüngerer Zeit durch CRISPR / Cas9 Targeting ^4-6. Alternativ können UV-Mutagenese schnell auxotrophen Mutanten auch in Hefestämmen erzeugen, für die Transformation mit mehreren Plasmiden ⁷ technisch schwierig ist. Während PCR-Targeting und CRISPR / Cas9 haben ausführlich an anderer Stelle beschrieben worden ist, in Teil präsentiert eine dieser Handschrift ein detailliertes Protokoll ist ein UV-Mutagenese-Ansatz beschreibt auxotrophe Stämme zu schaffen, die für die negative Selektion erlauben, anstatt positive Antibiotika-Selektion von Hefe-Transformanten.

Der nächste Schritt in der notwendigen Verwendung des auxotrophen Stämme für die orale Verabreichung von heterologen Protein ist Hefe-Transformation mit Plasmid-DNA. Seit der ersten erfolgreichen Transformation von Yeast Sphäroplasten für Saccharomyces cerevisiae 1978 berichtete ⁸ wurden zahlreiche Modifikationen charakterisiert worden, um die Effizienz zu erhöhen und die Leichtigkeit, mit der Hefe-Arten können genetisch modifiziert werden. Verwendung der Elektroporation für die erfolgreiche Transformation von DNA in S. cerevisiae wurde zuerst im Jahr 1985 beschrieben und ⁹ wurde durch Zugabe von 1 M Sorbit Inkubation osmotisch Stützzellen ¹⁰ seit verbessert. Elektroporation Effizienz ist zu den Hefearten und Dehnung gezeigt abzuhängen, Zellzahl und Wachstumsphase, Elektroporation Volumen Feldstärke weiterhin worden, und spezifische Puffer ^11. Lithiumacetat (LiOAc) Transformation, die ursprünglich von Ito et al. ^12, gehört zu den am häufigsten verwendeten Transformationsprotokolle, wie es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Weitere Analysen zeigten, dass die Effizienz der LiOAc Hefetransformation stark erhöht, wenn die Zellen in der mittleren logarithmischen Phase gesammelt werden,des Wachstums und in der Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) und DNA bei 42 ° C ¹² Hitzeschock. Inkubation von Voll intakte Hefe mit PEG ist wesentlich für eine effiziente Transformation, möglicherweise durch die Verbesserung der Befestigung von DNA an die Zellmembran wie auch über andere Auswirkungen auf die ^{Membran 13.} Lithium selbst erhöht auch die Durchlässigkeit von intakten Zellen ^14. Obwohl die meisten Labor S. cerevisiae-Stämme LiOAc Transformation leicht transformiert werden können, ^3, andere Hefearten effizienter werden können unter Verwendung alternativer Protokolle transformiert. Pichia pastoris, zum Beispiel die meisten effizient transformiert via Elektroporation statt LiOAc Transformation ^13. Entscheidend ist daher zu prüfen, multiple Methoden der Transformation und Inkubationszeiten und Reagenzienkonzentrationen zu optimieren, wenn sie genetisch eine nicht charakterisierte Hefestamm ändern versucht. Dieses Manuskript beschreibt somit sowohl LiOAc transformation und Elektroporation als Techniken für die Transformation der auxotrophen Mutante und Wildtyp S. boulardii. Interessierte Leser sind für eine gründliche Beschreibungen über die Entwicklung der Hefe-Transformation, alternative Protokolle und weitere Diskussionen über mögliche Wirkmechanismen ^13,15 auf die jüngsten Bewertungen gerichtet. Transformation von Hefe mit dem Plasmid ein leicht nachweisbares Protein codiert, ist weiterhin wesentlich für nachgeschaltete Tests, um eine geeignete Expression und Funktion des heterologen Proteins zu gewährleisten. Vielzahl verschiedener Proteine ​​kann in Abhängigkeit von dem Endzweck des therapeutischen Studie ausgewählt und die Antikörper zum Proteinnachweis durch Immunoblotting, ELISA und andere Techniken. Protokolle für diese Techniken gründlich anderswo ^16,17 beschrieben worden sind, und kann verwendet werden Niveaus von heterologen Proteinproduktion durch Vergleich mit Standardkurven von transformierten Hefe zu bestimmen. Für die Zwecke der Demonstration und zu zeigen,erfolgreiche Produktion eines sehr häufig verwendeten Protein in Hefe Biologie, stellt dieses Manuskript Transformation mit Plasmid-Codierung grün fluoreszierende Protein (GFP), die unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie zum anschließenden Nachweis ermöglicht.

Ebenso wichtig für die Herstellung von probiotischen Organismen, die heterologes Protein ist die richtige Verwaltung und Nachweis dieser Mikroorganismen in gastrointestinalen Geweben exprimieren, wie in Teilen drei und vier beschrieben. Verabreichung von rekombinanten Hefe per Schlundsonde ermöglicht die Abgabe von kontrollierten Mengen von Hefe direkt in den Magen, von der C57BL / 6-Mäuse von Erbrechen ¹⁸ natürlich nicht in der Lage sind. Allerdings, unsachgemäße Behandlung der Tiere und eine Magensonde kann zu Speiseröhrenschäden und Perforation, Magendurchbruch, Luftröhren Verwaltung führen und Aspirationspneumonie ^19,20. Schlechte Technik und Unerfahrenheit kann weiterhin Variabilität in murine Immunantworten und experimentelle resu erhöhenLTS, die zu den Tier Stress auf orale Gabe ^21,22 zugeschrieben wurden. Praxis in der richtigen Technik kann somit nicht nur Tier Beschwerden dämpfen, sondern auch Präzision der experimentellen Ergebnisse zu erhöhen. Dieses Manuskript beschreibt und veranschaulicht die Behandlung der Tiere und orale Gabe für die Verwaltung der kontrollierten Dosen von rekombinanten Hefe.

Schließlich ist es wichtig, erfolgreiche Zustellung von rekombinanten Hefe zu bestätigen, indem lymphoide Gewebe auf das Vorhandensein von Hefen und heterologen Proteins zu analysieren. Die Magen-Darm-Gewebe, die Immun kann am einfachsten und vorhersehbar auf die Gegenwart von Hefe zu prüfen sind die Peyer-Plaques. Peyer-Plaques sind sekundären lymphatischen Organe entlang des Dünndarms, die wichtigsten Standorte der Schleimhautimmunantwort Induktion ²³ sind. Antigene aus dem Lumen sind durch transzellulär microfold (M) Zellen im Epithel überführt und in den Peyer-Plaques freigegeben, so umschließen Aussetzend Antigen-präsentierenden Zellen Lumen Inhalt Darm. Obwohl Partikelaufnahme über das Darmepithel kann auch durch Becherzellen erreicht werden, haben diese Zellen nur Partikel nehmen weniger als 0,02 & mgr; m im Durchmesser ²⁴ gezeigt. Transepithelialen Dendriten erstreckte sich von CD103 ⁺ dendritische Zellen (DC) auch kleine Partikel aus dem Darmlumen ²⁵ aufnehmen; gibt es jedoch noch keine Berichte zeigen, dass CD103 ⁺ DCs Partikel aufnehmen größer als Bakterien. Somit intakt probiotischen Hefe, des Durchschnittsgröße zwischen 3-6 um im Durchmesser, sind höchstwahrscheinlich durch M-Zellen aufgenommen zu werden und mit den Peyer-Plaques übertragen. Beschrieben ist hier ein Protokoll für die Sammlung und das Screening von Peyer-Plaques für lebensfähige rekombinante Hefen, obwohl dieses Verfahren auch leicht zur Auswertung Aufnahme von probiotischen Bakterien angepasst werden kann.

Zusammenfassend Beurteilung rekombinanten probiotischen Hefe für die Lieferung von dierapeutic Proteine ​​in den Darm erfordert Kenntnisse in Labortechniken der Molekularbiologie auf die Behandlung der Tiere und Immunologie überspannt. Präsentiert hier sind Protokolle für 1) die Erzeugung und das Screening von auxotrophen Hefestämmen, die leicht negativ ohne Antibiotika ausgewählt werden können, 2) alternative Protokolle zu verwandeln Hefe und ermöglichen die Expression von heterologen Proteins, 3) Demonstrationen der richtigen Tierhandhabungstechniken und orale Gabe für intragastric Lieferung von rekombinanten Hefe, und 4) Protokolle für Patch Dissektion der Peyer und Screening für lebensfähige rekombinante Hefen und funktionellen heterologen Proteins. Zusammen werden diese Protokolle für die Erzeugung und Prüfung eines probiotischen Hefestamm ermöglichen Lage ist, an den Gastrointestinaltrakt heterologe therapeutische Protein zu liefern.

Protocol

1. UV-Mutagenese zu generieren auxotrophen Hefestämmen Geneüberlebenskurven benötigten Dosen von UV-Bestrahlung zu bestimmen Bereiten YPD (Hefeextrakt Pepton Dextrose) Medien und andere in Tabelle 1 Reagenzien nach Standardverfahren 26 und inokulieren Einzelkolonien in 5-10 ml YPD-Medien. Inkubieren Kulturen auf einer Rolltrommel bei 30 ° CO / N für mindestens 8 Stunden bis zur Sättigung. Bestimmen die Zellkonzentration von O / N-Kulturen unter Verwendung e…

Representative Results

Erzeugung einer Überlebenskurve nach der UV-Bestrahlung erfordert Plattieren verdünnt Hefezellen so dass verschiedene koloniebildenden Einheiten (CFU) zu bilden vermögen. Jede 500 & mgr; l Probe entnommen, wie oben beschrieben, enthält etwa 5 x 10 6 Zellen; jedoch größer als 100 Kolonien pro Platte sind schwierig, genau zu unterscheiden. Plattieren unverdünnten Probe sowie seriellen Verdünnungen von 1.10 bestrahlten Zellen gewährleistet somit, dass CFU kann an jed…

Discussion

Zusammen beschreiben die Protokolle hier die wesentlichen Schritte, die für die Entwicklung und Erprobung von auxotrophen probiotische Hefe-Stämme für die Lieferung von heterologen therapeutischen Proteins in den Darm. Diese Manipulation und Prüfung von rekombinanten probiotischen Hefe erfordert Techniken und Mittel, mit denen jeder einzelnen Labor derzeit nicht vertraut sind. Obwohl also zahlreiche frühere Studien, die über Protokolle für mehrere Hefe und Maus-Stämme beschrieben haben, haben diese Methoden nich…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053