Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Summary

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Abstract

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Introduction

In – vivo – Bildgebung bietet eine direkte Visualisierung von zellulären Verhalten in der die meisten physiologischen Kontext. Die Transparenz der Genaktivität, deren schnelle und externe Entwicklung und eine reiche Auswahl an genetischen Werkzeugen , die Fluoreszenz – Markierung ermöglichen , sind alle auf den wachsenden Einsatz von In – vivo – Mikroskopie beigetragen , die Dynamik der wichtigsten Entwicklungsereignisse aufzuklären. Imaging – Studien von Entwicklung des Nervensystems in Zebrabärbling haben zum Beispiel unser Wissen über das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen und das Schicksal ihrer Nachkommen einschließlich ihrer späteren Migration erweitert, Differenzierung und Schaltungsintegration ^1-8.

Die Bühne ist nun eingestellt, die subzellulären Dynamik zu untersuchen, diese zellulären Verhaltensweisen zugrunde liegen. Tatsächlich sind, Zebrabärbling bereits als Werkzeuge werden für die in vivo Zellbiologie ausgebeutet. Es ist nun möglich , die Mitochondrien zu visualisieren ^9-11, Zentrosomen ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵, Die Mikrotubuli ⁴ und Aktin – Zytoskelett ^16, Endosomen ¹⁷ und Komponenten des Apikalmembran komplexen ^1.18 unter anderem subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo. Bisher viel von dem, was über die Funktion dieser Organellen bekannt ist, kommt von ihrem Verhalten in kultivierten Zellen zu studieren. Während de – vitro – Studien enormen Einblick in die Zellbiologie ergeben haben, Zellen in Kultur repräsentieren nicht vollständig die Komplexität der in vivo – Situation und daher nicht notwendigerweise die Funktion und Dynamik subzellulärer Organellen in vivo widerspiegeln. Zebrabärbling – Embryonen bieten eine tragfähige in vivo alternative subzellulären Dynamik zu untersuchen.

Da Vertebraten besitzen Zebrabärbling viele Organsysteme (beispielsweise neurale Netzhaut), die mit denen in Säugetierspezies gefunden homolog sind. Zusätzlich werden Genaktivität zunehmend eingesetzt, um menschliche Krankheiten zu modellieren ^19,20 </snach oben> (Mikrozephalie ²¹ und Leber ²² kongenitale Amaurose zB) einschließlich und auf die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit zentrosomalen Funktion (zB Parkinson – Krankheit ^23, Tauopathies ^10,24 und Barth – Syndrom ^25). In – vivo – Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene in diesen Fällen wird ein besseres Verständnis der Zellbiologie erlauben diese pathologischen Zustände zugrunde liegen.

Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methoden ist es, eine umfassende Anleitung zur Verfügung zu stellen Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo Lichtmikroskopie zu untersuchen. Der gesamte Arbeitsablauf beteiligt bei der Visualisierung und Verfolgung von subzellulärer Strukturen in vivo beschrieben – von der genetischen Markierung Ansätze zur Erzeugung von transiente Expression und stabile transgene Fische und schließlich mit großem Feld und konfokale Mikroskopie auf Bildgebung. Während jedes dieser procedures von zahlreichen Zebrabärbling Laboratorien verwendet wird, die beschriebenen Protokolle werden optimiert und rationalisiert für die Dynamik subzellulärer Strukturen zu untersuchen. Zwei spezifische Aspekte der Arbeit hier beschriebenen rechtfertigen erwähnt: Erstens, die Verwendung des Gal4-UAS-Expressionssystems in verschiedenen Konfigurationen zu genetisch Etikett Organellen in bestimmten Zelltypen. Zweitens ist ein direkter Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild subzellulärer Strukturen in vivo.

Aktuelle Strategien zur genetisch Label Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrabärbling entweder nutzen verkappte mRNA ^1,4,8 oder DNA – basierte Konstrukte , wo Promotorelemente , die Expression von Fusionsproteinen ^9,14,15 direkt fahren. In vitro transkribierten RNA gekappt Ergebnisse in schnelle und breite Ausdruck, das ist aber nicht gewebespezifisch. Zusätzlich verringern Expressionsniveaus im Laufe der Zeit als das verkappte RNA verdünnt wird oder abgebaut. Somit ist die Verwendung von RNA-basiertenKonstrukte zu Organell Dynamik in späteren Stadien in der Entwicklung beschränkt ist (in der Regel bis zu 3 Tage nach der Befruchtung) untersuchen.

Diese Einschränkungen können durch die Verwendung von DNA-Konstrukten überwunden werden, wo räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression durch spezifische Promotorelemente bestimmt wird. Wenn DNA – Konstrukte basieren in Kontext der Gal4-UAS – System wesentliche Verbesserungen an Transgen – Expressionsniveaus verwendet werden , werden ^26,27 beobachtet. In diesem bipartite Expressionssystem, Zelltyp-spezifische Promotorelemente treiben, die Expression eines Transkriptionsaktivators Gal4, während Reportergenen stromabwärts von der Gal4-Bindungsstromaufwärts Aktivierungssequenz kloniert werden (UAS). Durch UAS Reporter mit entsprechenden Gal4 Treiber kombinieren, können die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränkt werden, wodurch die Notwendigkeit umgangen werden jedes Mal zu klonen Reportergene hinter verschiedenen Promotoren eine spezifische Expressionsmuster gewünscht wird. Des Weiteren kann die Expression mehrerer UAS Reportergene seindurch einen einzigen Gal4 Aktivator angetrieben. Das Gal4-UAS-System stellt somit ein vielseitiges und flexibles genetischer Ansatz für subzelluläre Kennzeichnung.

Breitfeld und konfokale Mikroskope sind die Arbeitstiere der meisten Laboratorien. Weitfeldsysteme typischerweise eine Bogenlampe als Lichtquelle verwenden, und das emittierte Licht mit einer empfindlichen Kamera erkennen, die am Ende des Lichtweges angeordnet ist. Diese Bildgebungsverfahren wird in der Regel auf dünne Proben beschränkt, wie Out-of Fokus Licht verschleiert im Fokus befindlichen Informationen in dickeren Proben. Die konfokale Mikroskope unterscheiden sich von Weitfeld – Systemen dadurch , dass sie gebaut werden Signale zu bevorzugen , die von der Fokusebene über diejenigen , die ihren Ursprung außerhalb des Fokus (dh "optischen Schneidens") ²⁸ stammen. Zu erreichen optischen Schneidens wird ein Pinhole im Emissionspfad in einer konjugierten Position zu der Punktlichtquelle angeordnet. Laser werden als Lichtquellen verwendet, und Signale werden mit Photomultipliern (PMTs) nachgewiesen. Praktisch wird ein LaserStrahl über die Probe Punkt-für-Punkt und der Fluoreszenzemission bei jedem Punkt (Pixel) swiped von der PMT detektiert wird.

Hier Bild, das wir die gleichen subzellulärer Strukturen in Genaktivität leben beide mit großem Feld und konfokaler Mikroskopie mit einem direkten Vergleich der beiden Mikroskopie Modalitäten zur Verfügung zu stellen. Die zugrunde liegende Ziel solcher Vergleiche der Bereitstellung ist es, Richtlinien zu bieten für die am besten geeignete Mikroskopietechnik für die spezifische Frage auf der Hand entschieden haben.

Mit Hilfe der beschriebenen Ansätze hier zeigen wir Gal4-UAS basiert die genetische Markierung der Mitochondrien und Zentrosomen. Diese Organellen sind in verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und in Muskelzellen abzubildenden Verwendung Weitfeld und konfokale Mikroskopie die Eignung jedes Bildgebungsmodalität zu demonstrieren. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht zur Untersuchung von anderen Organellen und subzellulären Strukturen im lebenden Zebrafischembryo angepasst werden.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften der Regierung von Oberbayern (München, Deutschland) durchgeführt. 1. Labeling Organell und andere subzellulärer Strukturen HINWEIS: Hier genetische Reporter – Konstrukte , dass fluoreszenz Tag Zentrosomen, Mitochondrien und Zellmembranen beschrieben werden. Verwenden Sie herkömmliche Klonierungsverfahren 29 – Fusionsproteine ​​zu erzeugen , …

Representative Results

Hier wird die Verwendung von Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild Mitochondrien und Zentrosomen in Genaktivität leben direkt verglichen und gegenübergestellt. Je nach Lage der Zellen in dem Organell Dynamik untersucht und die Eigenfrequenz der spezifischen subzellulären Ereignisse zu werden, im allgemeinen entweder Weitfeld oder konfokalen Mikroskopie ist die bessere Wahl. Wir abzubildenden Organellen in RB Neuronen auf der Oberfläche des Embryos und in Netzhautzellen befindet tie…

Discussion

Hier zeigen wir die Vielseitigkeit des Gal4-UAS – Expressionssystem zur fluoreszenz tag Mitochondrien Zentrosomen und die Zellmembranen von spezifischen Zelltypen in vivo in Zebrabärbling – Embryonen. Viele fluoreszierende Fusionsproteine ​​, die andere Organellen oder subzellulärer Strukturen beschriften kann in der veröffentlichten Literatur zu finden und kann von dem jeweiligen Labor, kommerziellen Quellen oder nichtkommerziellen Plasmid Hinterlegungsstellen (zB Addgene) erhalten werden. Zu e…

Materials

Agarose (2-hydroxyethylagarose)	Sigma-Aldrich	A4018-10G	Low-gelling temperature Type VII
Block heater	Eppendorf		Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%	Aldrich	202967-50g	To prepare 30x Danieau's
CCD camera	Qimaging	Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps	Dumont – Fine Science Tools	11252-50	#5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope	Olympus	FV1000 Fluoview
Culture dish heater	Warner Instrument Corporation	DH-35	Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt	Fluka Analytical	A5040-100G	Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope	Leica	M205 FA
GeneClean kit	MP Biomedicals	111001200
Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35G-0-14-C	35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles	World Precision Instruments Inc.	TW100F-4	For microinjections
HEPES	Sigma	H3375-250g	To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease	Dow Corning	DCC000001242 150g	Silicon dioxide grease
Incubator	Thermo Scientific	Heraeus	To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C
KCl 99%	Sigma-Aldrich	S7643-5kg	To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	230291-500g	To prepare 30x Danieau's
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet
Microloader tips	Eppendorf	930001007	0.5-20uL
Micromanipulator	Maerzhaeuser Wetzlar	MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder	Intracel	P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Ambion	AM1340	To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%	Sigma-Aldrich	P9541-1kg	To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer			To measure DNA/RNA concentration
Needle puller	Sutter Instrument	P-1000	Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W	Nikon		Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98%	Sigma	P7629-10G	PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes	Sarstedt AG	821472	92 x 16mm
Plastic molds	Adaptive Science Tools	TU-1	For microinjections
Plexiglas cover-with a hole	Custom-made		The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic)			To collect zebrafish eggs
Temperature controller	Warner Instrument Corporation	TC-344B	Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes	Sarstedt AG	86.1171	3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W	Olympus		Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W	Olympus		Water-dipping-cone objective
Widefield microscope	Olympus	BX51WI
PTU (50x Stock)			Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature  Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock)			Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7  Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock)			1740 mM  NaCl  <21 mM      KCl  12 mM      MgSO4.7H2O  18 mM      Ca (NO3)2 150 mM    HEPES buffer  Distilled water upto 1 L  Store at 4 oC  Use at 0.3x working solution