Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Peter Engerer; Gabriela Plucinska; Rachel Thong; Laura Trovò; Dominik Paquet; Leanne Godinho

doi:10.3791/53456

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Article de méthode

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

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DOI :

10.3791/53456

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2 avril 2016

Peter Engerer¹ , Gabriela Plucinska¹^,² , Rachel Thong¹^,³ , Laura Trovò¹ , Dominik Paquet⁴^,⁵^,⁶ , Leanne Godinho¹

¹Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, ²Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, ³Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, ⁴Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, ⁵German Center for Neurodegenerative Diseases, ⁶Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

Dans cet article

Résumé

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Résumé

L’imagerie in vivo offre un accès sans précédent au comportement dynamique des structures cellulaires et subcellulaires dans leur contexte naturel. La réalisation de telles expériences d’imagerie chez des vertébrés supérieurs tels que les mammifères nécessite généralement un accès chirurgical au système étudié. L’accessibilité optique des poissons-zèbres embryonnaires et larvaires permet de contourner ces procédures invasives et permet l’imagerie dans l’organisme intact. En effet, le poisson-zèbre est maintenant un modèle bien établi pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques à l’aide de la microscopie in vivo dans un large éventail de contextes de développement, de la prolifération à la migration et à la différenciation. Un développement plus récent est l’utilisation croissante du poisson-zèbre pour étudier les événements subcellulaires, y compris le trafic mitochondrial et la dynamique des centrosomes. La relative facilité avec laquelle ces structures subcellulaires peuvent être marquées génétiquement par des protéines fluorescentes et l’utilisation de techniques de microscopie optique pour les imager transforment le poisson-zèbre en un modèle in vivo de biologie cellulaire. Nous décrivons ici des méthodes permettant de générer des constructions génétiques qui marquent des organites par fluorescence, en mettant en évidence les mitochondries et les centrosomes comme exemples spécifiques. Nous utilisons le système bipartite Gal4-UAS dans plusieurs configurations pour restreindre l’expression à des types de cellules spécifiques et fournir des protocoles pour générer des poissons transgéniques stables et exprimant transitoirement. Enfin, nous fournissons des lignes directrices pour choisir les méthodes de microscopie optique les plus appropriées pour l’imagerie de la dynamique subcellulaire.

Introduction

L'imagerie in vivo fournit une visualisation directe des comportements cellulaires dans le contexte le plus physiologique. La transparence des embryons de poisson zèbre, leur développement rapide et externe et un riche éventail d'outils génétiques qui permettent l' étiquetage fluorescent ont tous contribué à l'utilisation croissante de la microscopie in vivo pour élucider la dynamique des événements clés du développement. Les études d'imagerie de développement du système nerveux chez le poisson zèbre ont par exemple considérablement élargi notre connaissance du comportement des cellules progénitrices neurales et le sort de leur p....