Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için
Summary
Otolog ve allojenik kemik greft implantasyonu önemli kraniofasial kemik kaybını tedavi yaklaşımları kabul teşkil. Oysa neovaskülarizasyon, hücre farklılaşması ve kemik oluşumu arasındaki etkileşime greft bileşiminin etkisi belirsizdir. Biz greft yakınlık anjiyogenez-osteogenesis bağımlılığın aydınlatmak için amaçlandığı multimodal görüntüleme protokol mevcut.
Abstract
Bir kemik greft prosedürün başarısını belirlemede önemli bir parametre greft çevredeki vaskularizasyon olduğunu. Biz bol kan damarı oluşumu ile daha kemik rejenerasyonu teşvik edecek bir kemik otogreftin o implantasyonu varsaydık. Defekt yerinde neovaskülarizasyon üzerinde greft etkisini araştırmak için, bir polimerizasyon kontrast madde ile hayvanın sistemik perfüzyon içeren kan damarlarını oluşturan yeni karakterize bir mikro-bilgisayarlı tomografi (uCT) yaklaşımını geliştirdi. Bu yöntem bütünüyle bir organın detaylı damar analiz sağlar. Buna ek olarak, kan perfüzyon kan yoluyla bulaşan bir flüoresan madde flüoresan görüntüleme (FLI) kullanılarak değerlendirildi. Kemik oluşumu, bir hidroksiapatit hedefli bir prob ve uCT analizi kullanılarak FLI ile nicelendirildi. Kök hücre alımı osteokalsin promoterinin kontrolü altında lusiferaz ifade eden bir transjenik farelerin biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile izlenmiştir.Burada tarif ve allogreft hazırlanması, kalvarial kusur ameliyatı göstermek, neovaskülarizasyon çalışma ve (kontrast madde in vivo perfüzyon dahil) kemik oluşum analizi ve veri analizi için protokol için uCT tarama protokolleri.
Damar 3D yüksek çözünürlüklü analizi, özellikle arteriol oluşumu ile ilgili olarak, implante greftli hayvanlarda önemli ölçüde daha büyük bir anjiyojenez gösterdi. Buna göre, kan perfüzyon ameliyat sonrası 7. gün otogreft grubunda anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Biz autograf alınan hayvanlarda üstün kemik mineralizasyonu ve ölçülen büyük kemik oluşumunu gözlendi. Hücreler 7. ve 10. günde arasındaki kemik oluşturan hücrelerin içine farklılaşan greft-konak kemik sütür için otogreft implantasyonu uyarılmış ikamet kök hücre alımı. Bu bulgu, gelişmiş kemik oluşumu atfedilebilir anlamındadırotogreft implantasyonu karakterize artar vasküler beslenmesi. Yöntemler sıkı sınırlı kemik oluşumu ve neovaskülarizasyon açısından kemik rejenerasyonu incelemek için en uygun araç olarak hizmet edebilir tasvir.
Introduction
Travma, tümör rezeksiyonu, dekompressif kraniyotominin ve konjenital defekte Kraniyofasiyal kemik kaybı nadiren tek başına iyileşir ve net bir klinik çözüm sunuyor. Otolog kemik grefti ve allojenik kemik grefti yoğun bu koşulları 1 tedavi etmek için kullanılır.
Bu yaygın osteogenesis sıkı anjiyojenez 2,3 ile birleştirilir kabul edilmektedir. Böylece, kemik rejenerasyonu için önerilen tedavinin tam çalışma, tüm kusur site genelinde oluşturan damar ağacının kapsamlı bir soruşturma içermelidir. Araştırma modellerinde damarlanmayı karakterize birkaç müsait yöntem vardır. Damar ağacı histolojik analizi ile incelenebilir. Histoloji doku kesit dayanır yana, ortaya çıkan görüntünün bozulmayacağı bir yüksek ihtimal. Bu sorunu çözmek için, intravital mikroskopi görüntü bozulmadan kan damarları 4 yapılabilir; Bununla birlikte, bu yöntemtek düzlemli görüntüleme sınırlayıcı. Kontrast madde ile perfüze edilmiş bir hayvandan elde edilen örneklerin uCT tarama yenilenmesi sitesi 5 besleyen damar ağının 3D görüntü sağlar. Bu yaklaşım bir bütün olarak organının damar oldukça detaylı gösteri yanı sıra, kan damarı dağılımının titiz analiz sağlar. Ayrıca, uCT kan damarlarının farklı alt tipleri karakterize kan damarlarının çeşitli çaplarda arasındaki farklılaşma sağlar.
Biz allogreft implantasyonu daha büyük neovaskülarizasyonu tetikleyecek bir kalvaryal otogreft bu implantasyonu hipotezi, ve bu, çeşitli teknikler kullanılabilir, bu hipotezi devam formation.To gelişmiş kemik da, yeni damar oluşumu yol açacaktır artmıştır. Biz uCT tabanlı analiz yaparak yeni oluşan damar ağacın desenleri araştırıldı. Biz kan havuzu floresan prob kullanılarak kan perfüzyonunu ölçülür. Sonra, eşekBir hidroksiapatit yönettiği prob ve uCT analizi FLI tarafından sed kemik dokusu mineralizasyonu. Son olarak, lusiferaz osteokalsin-pozitif hücrelerde ifade edildiği transjenik farelerde BLI performans, kök hücre farklılaşması işe alım ve izlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan multimodal görüntüleme yaklaşımlarının amacı kafatası kemik grefti bağlamında anjiyogenez-osteogenesis ekseninin titiz bir soruşturma sağlamaktır. Neovaskülarizasyon tüm kranial kusur besleyen damar ağacın doğru yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu gösteri izin uCT protokolü kullanılarak görüntülendi. uCT veriler kolayca gibi IPL yazılımı gibi gelişmiş araçlar kullanılarak analiz edilebilir. Örneğin, Şekil 3C'de gösterildiği kal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
