التصوير المقطعي والتصوير الضوئي من-تكون العظم الأوعية الدموية اقتران لتقييم دمج القحف طعم ذاتي العظام والمغايرة
Summary
زرع الطعوم العظمية ذاتي وخيفي تشكل قبول النهج لعلاج الرئيسية فقدان العظام القحفي. ومع ذلك، فإن تأثير تكوين الكسب غير المشروع على التفاعل بين اتساع الأوعية الدموية، تمايز الخلايا وتكوين العظام غير واضح. نقدم بروتوكول التصوير المتعدد الوسائط التي تهدف إلى إلقاء الضوء على الترابط الأوعية الدموية، تكون العظم في القرب الكسب غير المشروع.
Abstract
معلمة الرئيسية التي تحدد نجاح أي إجراء ترقيع العظام هي الأوعية الدموية للمنطقة المحيطة الكسب غير المشروع. افترضنا أن غرس الطعم الذاتي عظم شأنه إحداث أكبر تجديد العظام التي فيرة تشكيل الأوعية الدموية. للتحقيق في تأثير الكسب غير المشروع على اتساع الأوعية الدموية في موقع الخلل، وضعنا التصوير المقطعي (μCT) نهج احتساب الدقيقة لتوصيف حديثا تشكيل الأوعية الدموية، الذي ينطوي على نضح النظامية للحيوان مع وكيل تبلمر التباين. تمكن هذه الطريقة تحليل الأوعية الدموية مفصل للجهاز في مجملها. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم نضح الدم باستخدام التصوير مضان (FLI) وكيل الفلورسنت التي تنتقل عن طريق الدم. وكان كميا تكوين العظام التي FLI باستخدام مسبار استهداف هيدروكسيباتيت وتحليل μCT. تم رصد تجنيد الخلايا الجذعية عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن luciferase المراسل تحت سيطرة المروج أوستيوكالسين.نحن هنا وصف وشرح إعداد المزروع، جراحة عيب قبي، μCT بروتوكولات المسح لدراسة اتساع الأوعية الدموية وتحليل تكوين العظام (بما في ذلك التروية في الجسم الحي من وكيل النقيض)، وبروتوكول لتحليل البيانات.
أظهر عالية الدقة 3D تحليل الأوعية الدموية أكبر بكثير الأوعية الدموية في الحيوانات مع طعم ذاتي زرع، وخاصة فيما يتعلق بتشكيل شرين. وفقا لذلك، ونضح الدم أعلى بكثير في المجموعة الطعم الذاتي قبل اليوم ال 7 بعد الجراحة. لاحظنا تمعدن العظام متميز ويقاس تكوين العظام أكبر في الحيوانات التي تلقت طعم ذاتي. الطعم الذاتي زرع المقيم الناجم عن تجنيد الخلايا الجذعية للخياطة العظام الكسب غير المشروع في استضافة، حيث خلايا متمايزة في الخلايا المكونة للعظام بين ال 7 و ال 10 يوم بعد العملية الجراحية. هذه النتيجة تعني أن تكوين العظام تعزيز يمكن أن يعزى إلىتغذية الأوعية الدموية المعزز الذي يميز الطعم الذاتي الزرع. الطرق المرسومة قد تكون بمثابة أداة مثلى لدراسة تجديد العظام من حيث تكوين العظام يحدها بإحكام واتساع الأوعية الدموية.
Introduction
فقدان العظام القحفي بسبب الصدمة، ورم استئصال، حج القحف ازالة الضغط، وعيب خلقي نادرا ما يشفى من تلقاء نفسه ويعرض الحاجة غير الملباة السريرية واضحة. تستخدم الطعوم العظمية ذاتي وترقيع العظام خيفي على نطاق واسع لعلاج هذه الظروف 1.
ومن المسلم به على نطاق واسع أن تكون العظم يقترن بشكل وثيق مع الأوعية الدموية 2،3. وبالتالي، يجب على دراسة كاملة من العلاج المقترحة لتجديد العظام تشمل تحقيق شامل الشجرة الوعائية تشكيل جميع أنحاء الموقع عيب بأكمله. هناك العديد من الطرق المتاحة لتوصيف الأوعية الدموية في النماذج البحثية. الشجرة الوعائية يمكن التحقيق فيها من قبل التحليل النسيجي. منذ الأنسجة تعتمد على باجتزاء الأنسجة، وهناك احتمال كبير أن يتم تشويه الصورة الناتجة. لمعالجة هذه المشكلة، intravital المجهري يمكن أن يؤديها للسفن صورة سليمة الدم (4)؛ ومع ذلك، وهذه الطريقةتقتصر على التصوير طائرة واحدة. μCT مسح العينات التي تم الحصول عليها من حيوان مع perfused عامل تباين يسمح التصوير 3D من شبكة الأوعية الدموية التي تغذي موقع تجديد 5. هذا النهج يسمح مظاهرة مفصلة للغاية من الأوعية الدموية جهازا ككل، فضلا عن التحليل الدقيق لتوزيع الأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، μCT يمكن التفريق بين أقطار متنوعة من الأوعية الدموية، التي تميز أنواع فرعية مختلفة من الأوعية الدموية.
افترضنا أن غرس الطعم الذاتي قبة القحف سوف تحفز اتساع الأوعية الدموية أكبر من زرع لالمزروع، وهذه الزيادة سوف اتساع الأوعية الدموية يؤدي، بدوره، إلى تعزيز العظام formation.To متابعة هذه الفرضية قمنا بتوظيف مجموعة متنوعة من التقنيات. نحن التحقيق أنماط من شجرة الأوعية الدموية التي شكلت حديثا عن طريق إجراء تحليل يستند μCT. قسنا التروية الدموية باستخدام بركة الدم الفلورسنت التحقيق. المقبلة، ونحن حميرسد تمعدن العظام من قبل FLI من تحقيق الموجهة هيدروكسيباتيت وتحليل μCT. وأخيرا، فإننا مراقبة تجنيد الخلايا الجذعية والتمايز، وأداء BLI في الفئران المعدلة وراثيا والتي يتم التعبير luciferase المراسل في خلايا أوستيوكالسين إيجابي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف من النهج التصوير المتعدد الوسائط الموصوفة هنا هو تمكين التحقيق الدقيق للمحور الأوعية الدموية، تكون العظم في سياق الجمجمة ترقيع العظام. تم تصوير اتساع الأوعية الدموية باستخدام بروتوكول μCT، مما سمح مظاهرة دقيقة 3D عالية الدقة من شجرة الأوعية الدموية المغذية للع…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
