Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos
Summary
Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.
Abstract
Um parâmetro importante que determina o sucesso de um procedimento de enxerto ósseo é vascularização da área circundante ao enxerto. Nossa hipótese é que a implantação de um enxerto ósseo induziria maior regeneração óssea por formação de vasos sanguíneos abundante. Para investigar o efeito do enxerto sobre a neovascularização no local do defeito, desenvolvemos uma tomografia (μCT) abordagem computadorizada de micro para caracterizar recém-formando vasos sanguíneos, o que envolve a perfusão sistêmica do animal com um agente de contraste de polimerização. Este método permite uma análise detalhada vascular de um órgão na sua totalidade. Além disso, a perfusão de sangue foi avaliado usando imagiologia de fluorescência (ILF) de um agente fluorescente transmitida pelo sangue. A formação óssea foi quantificada por FLI usando uma sonda segmentadas por hidroxiapatita e análise μCT. O recrutamento de células estaminais foi monitorizada por meio de imagem de bioluminescência (BLI) de ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina.Aqui descrevemos e demonstrar a preparação de aloenxerto, cirurgia defeito calvária, protocolos de digitalização μCT para o estudo neovascularização e análise da formação óssea (incluindo a perfusão in vivo de agente de contraste), e o protocolo para a análise de dados.
A análise de alta resolução da vasculatura 3D demonstraram significativamente maior a angiogénese em animais implantados com autoenxertos, especialmente no que diz respeito à formação das arteríolas. Assim, a perfusão de sangue foi significativamente maior no grupo de auto-enxerto pelo 7º dia após a cirurgia. Observou-se a mineralização do osso superior e formação óssea maior medido em animais que receberam autoenxertos. Implantação autotransplante residente induzido recrutamento de células-tronco para a sutura do enxerto ósseo-hospedeiro, em que as células diferenciadas em células formadoras de osso entre o 7º e 10º dia pós-operatório. Esta descoberta significa que a formação óssea aumentada pode ser atribuída aa alimentação vascular aumentada, que caracteriza o implante auto-enxerto. Os métodos apresentados poderão servir como uma ferramenta ideal para estudar a regeneração óssea em termos de formação de osso bem delimitada e neovascularização.
Introduction
Perda óssea devido ao trauma craniofacial, a ressecção do tumor, craniotomia descompressiva, e defeito congênito raramente cura por si só e apresenta uma necessidade clínica não satisfeitas clara. Enxertos ósseos autólogos e alogênicos enxertos ósseos são amplamente utilizados para tratar estas condições 1.
É amplamente aceito que osteogênese é intimamente ligado com a angiogênese 2,3. Assim, o estudo completo de uma terapia proposta para regeneração óssea deve incluir uma investigação exaustiva da árvore vascular formando ao longo do sítio do defeito completo. Existem vários métodos disponíveis para caracterizar a vascularização em modelos de pesquisa. A árvore vascular pode ser investigado por análise histológica. Desde histologia depende de seccionamento de tecidos, existe uma alta probabilidade de que a imagem resultante será distorcida. Para resolver este problema, microscopia intravital pode ser realizada para vasos sanguíneos imagem intacta 4; No entanto, este método élimitado a um plano de imagem. μCT digitalização de espécimes provenientes de um animal perfusão com agente de contraste permite imagens em 3D da rede vascular que alimenta o local de regeneração 5. Esta abordagem permite uma demonstração altamente detalhada da vasculatura de um órgão como um todo, assim como uma análise minuciosa de distribuição dos vasos sanguíneos. Além disso, permite a diferenciação entre μCT diâmetros variados de vasos sanguíneos, que caracterizam os diferentes subtipos de vasos sanguíneos.
Nossa hipótese é que a implantação de um auto-enxerto calvarial irá induzir maior neovascularização do que a implantação de um aloenxerto, e este aumento da neovascularização levará, por sua vez, para o reforço da osso formation.To perseguir essa hipótese nós empregamos uma variedade de técnicas. Foram investigados os padrões da árvore vascular recém-formada através da realização de uma análise baseada em μCT. Medimos perfusão sanguínea utilizando uma sonda fluorescente sangue-piscina. Em seguida, nós burrosmineralização do tecido ósseo sed por FLI de uma sonda dirigida por hidroxiapatita e análise μCT. Finalmente, monitorizada recrutamento de células estaminais e diferenciação, realizando BLI em ratinhos transgénicos em que a luciferase é expressa em células de osteocalcina-positiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objectivo das abordagens de imagem multimodais aqui descritas é permitir meticulosa investigação do eixo angiogénese-osteogénese no contexto de enxerto de osso craniano. A neovascularização foi fotografada utilizando um protocolo μCT, o que permitiu uma alta-resolução demonstração 3D exacta da árvore vascular que alimenta todo o defeito craniano. μCT dados podem ser facilmente analisados utilizando ferramentas avançadas como software IPL. Por exemplo, a análise de espessura mostrado na</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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