Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com pós-coluna de derivação (PCD) é uma poderosa ferramenta que é útil para resolver uma série de questões em laboratório analítico. Ele pode ser usado para detectar compostos que são de outra forma indetectável, com o conjunto de detectores disponíveis ^1,2, aumentar o sinal do analito alvo, o que permite que os limites inferiores de detecção e quantificação ^3-5 ou derivatizar selectivamente um analito alvo, a fim de evitar efeitos de matriz ^6. PCD reacções comumente usados ​​incluem a reacção de aminas, tais como aminoácidos, com orto-phthaladehyde ^7-9, ninidrina ^9,10 ou ^11,12 fluorescamina, a derivatização de espécies reactivas de oxigénio (ROS) com a 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicais DPPH ^{(•) 13,14} ou 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) ^15,16, e o uso do reagente de iodeto-azida para derivatizar enxofre ccompostos ontaining ^17,18.

Existem, no entanto, numerosos inconvenientes para a utilização de reacções de PCD com sistemas de HPLC ^6. Principalmente entre estes é a utilização de bobinas de reacção entre o ponto de adição do reagente de derivatização (s) e o detector, que permite que o tempo para a mistura e a reacção ocorra ^8. Estes laços de reacção muitas vezes têm volumes de 500 uL ou mais, o que é significativo em comparação com o volume do restante do sistema de HPLC ^19. A utilização destes reacção alto volume ciclos resulta em aumento de alargamento do pico em relação ao que seria observada sem a presença do circuito de reacção. Isto resulta em picos menores, mais largas que têm limites superiores de quantificação e de detecção e resolução cromatográfica negativamente os efeitos. As Figuras 1 e 2 destacar a deterioração da forma do pico que resultam da adição de vários volumes de coluna de ansa reacção pós. esta análisefoi realizado com uma composição de fase móvel de 94% de metanol e 6% de água Milli-Q. O caudal da fase móvel foi de 1 ml / min, o volume de injecção foi de 20 pi e o comprimento de onda análise foi 265 nm. foram inseridos bobinas de diferentes volumes mortos a partir de 20 uL a 1.000 ul entre a coluna e o detector para simular os efeitos de volume morto ciclo de reacção em métodos de PCD. Estes laços foram preparados a partir de tubagem de aço inoxidável de diâmetro interno de 0,5 mm. A experiência foi realizada num sistema de HPLC consiste de um controlador (SCL-10AVP), uma pressão baixa Gradiente válvula (FCL-10ALVP), uma bomba (LC-20AD), um injector (SIL-10ADVP), e um detector de PDA ( SPD-M10ADVP). A fase móvel foi bombeada através de um desgaseificador, antes da introdução no sistema de HPLC. A separação foi efectuada utilizando um x 4,6 mm ID 5? M 250 milímetros. As condições experimentais foram escolhidas para ser típica de reacções de PCD que foram recentemente publicados na literatura.

omais simples, mais comum pós configuração do reactor de coluna é denominado um reactor tubular não segmentada que é efectivamente um tubo longo, fino, através do qual o líquido pode fluir e a reacção pode ter lugar. Neste sistema de alargamento de pico é dependente não apenas o volume morto adicionado ao sistema, mas também o diâmetro interno do tubo, como realçado por Iijima et al. ^8. Além disso, a geometria da bobina desempenha um papel na ampliação da marca observada. Stewart ²⁰ indicou que enrolamento do reactor muda os perfis de fluxo secundário, o que resulta em uma melhor mistura, o que significa que o volume morto pode ser minimizada. Tem sido afirmado que o pico ampliação não é significativo quando se usa um tubo aberto malha bobina ^21. Quando o alargamento do pico é excessivamente grande, outros tipos de reactores também podem ser considerados ^20,22. Estes podem incluir reatores de leito ou reatores de fluxo segmentado. Estes reactores são particularmente úteis para reacções lentas que de outra forma protece grande reação laços. Como reactores tubulares não-segmentadas são os tipos mais comuns de reatores utilizados em aplicações de PCD, o resto deste artigo lida com este tipo de configuração do reator.

O desenho da coluna de fluxo de reacção (RF) incorpora uma montagem final de multi-porta que permite fase móvel para sair (ou enter) a coluna, quer através de uma única porta situada na região central radial da coluna ou três portas localizadas no exterior zona da parede da coluna (ver Figura 3). Estes dois fluxos são separados usando uma montagem final contendo uma frita porosa central que está rodeada por um anel impermeável que é por sua vez rodeado por uma frita porosa externa que se estende para fora da parede da coluna. Devido ao fluxo de anel de cruzeta impermeável central não é possível entre as duas regiões porosas.

Durante a cromatografia de fluxo reacção, o reagente (s) de derivatização são bombeados contra a direcção do fluxo da fase móvel em um ou TWo das portas exteriores da coluna de fluxo reacção. O eluente da coluna é misturado com o reagente (s) derivatização na frita exterior e passado para o detector por meio de uma porta exterior livre. fluxo reacção pode ser utilizada tanto para uma derivatização reagente único (uma porta para o reagente de derivatização, uma porta para passar o eluente da coluna para o detector e uma porta bloqueada) ou um sistema de reagentes dupla (2 portas para os reagentes de derivatização e uma porta de passar o eluente da coluna para o detector). O fluxo da corrente central pode ser usado para detectar o eluente da coluna não derivatizado, de forma eficaz de detecção de multiplexação ^23, ou passado para o lixo.

Uma técnica importante de sintonização que é disponível quando executado cromatografia RF-PCD é a razão entre os fluxos de centrais e periféricos. A razão óptima para cada derivação depende de um número de factores tais como se o fluxo central irá ser detectado ou passado para o lixo. Por conseguinte, uma vez que a razão óptima foi determinada, Deve garantir-se que o rácio fluxo correto é alcançado antes de cada corrida a ser realizada.

Verificou-se que a utilização de uma frita para misturar o fluxo de eluente de coluna e o reagente de derivatização em RF-PCD resulta em uma mistura mais eficiente em comparação com técnicas de mistura tradicionais que empregam tipicamente uma peça em T volume morto zero ou de baixo volume morto W- peça de misturar as duas correntes. Isto permitiu a utilização de relativamente pequenas laçadas de reacção, ou mesmo a eliminação da laçada de reacção completamente. A redução dos resultados de reacção de tamanho de malha em mais nítidas picos em comparação com métodos tradicionais de derivatização pós-coluna. Isto significa que, apesar do facto de nem todo o eluente da coluna é derivatizado, maior sinal para relações de ruído são observados e, portanto, os limites inferiores de detecção e de quantificação pode ser conseguida.

cromatografia de fluxo reacção foi desenvolvido para ultrapassar as dificuldades com a adaptação de reacção PCDs a colunas de HPLC modernos sistemas e, em particular a perda de eficiência causada por banda alargando devido a volumes mortos pós-coluna grandes causadas pela necessidade de empregar um grande volume de reacção de laços. Os processos de mistura mais eficientes na FR-PCD em comparação com PCD convencional significa que os volumes de ansa de reacção mais pequenas podem ser empregues levando a um aumento na eficiência de separação observada. Além disso cromatografia RF-PCD mostra tanto o aumento do sinal e ruído diminuiu em comparação com técnicas convencionais de PCD, resultando em limites inferiores de detecção e quantificação, em comparação com os métodos convencionais de PCD. Uma vantagem adicional de RF-PCD em comparação com os métodos convencionais de PCD é a capacidade de controlar o fluxo não derivatizado, que elui a partir da porta central da coluna de RF, assim como o fluxo de derivatizado que elui a partir da região periférica da coluna. RF-PCD é uma técnica relativamente nova, mas promissora que apresenta muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais de PCD.

<p class="jove_content"> Conexão da coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC.

Protocol

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de …

Representative Results

O primeiro método de PCD que foi adaptado para utilização por RF-CPD foi a derivatização de antioxidantes, utilizando o radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Esta reacção foi introduzido por Koleva et al. 25, e tem sido amplamente utilizada desde então. A detecção se baseia na descoloração do radical DPPH • na presença de espécies de oxigénio reactivas, portanto, a presença de antioxidantes resulta numa queda na absorvância observada. …

Discussion

RF-PCD permite a mistura eficiente do reagente de derivatização com o efluente pós-coluna de HPLC, sem a utilização de bobinas de reacção, minimizando os efeitos de alargamento de banda e melhorar o desempenho da separação. métodos de RF-PCD também mostraram melhorias na resposta de sinal em relação ao método de detecção. Camenzuli et al. ²⁸ foi o primeiro a reportar o uso de colunas de fluxo de reacção com DPPH ^• para a detecção de ROS em uma amostra de café espress…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30