Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering
Summary
Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.
Abstract
Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.
Introduction
Nanostrukturierte Oberflächen haben in jüngster Zeit erhebliche Aufmerksamkeit aufgrund ihrer verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich Strukturierung, Zellkultur, Reinigung und Oberflächenumschaltung. Zum Beispiel superhydrophoben Oberflächen , die durch die Nanostruktur des Lotusblattes inspiriert und andere ansprechende Oberflächen sind in der Lage 1-4 auf äußere Reize reagieren.
Die Langmuir-Film ist eine der am häufigsten untersuchten Polymerbeschichtungen. Ein Langmuir – Film wird durch Eintropfen amphiphilen Molekülen auf einem Luft-Wasser – Grenzfläche 5-8 gebildet. Der Film kann dann durch physikalische oder chemische Adsorption und die molekulare Konformation auf einer festen Oberfläche auf einer festen Oberfläche übertragen werden kann unter Verwendung von vertikalen und horizontalen Übertragungsmethoden 9-12 gesteuert werden. Die Dichte des Langmuir-Film kann präzise durch Komprimieren der Luft-Wasser-Grenzfläche zu regeln. In jüngster Zeit hat dieses Verfahren auch zur Herstellung von nanoskaligen sea-island Structur bewährtes durch amphiphile Blockcopolymere verwendet. Die Nanostrukturen angenommen eines Kerns aus hydrophoben Segmenten bestehen und eine Schale aus hydrophilen Segmente 13-17. Darüber hinaus wird die Anzahl von Nanostrukturen auf einer Oberfläche durch Steuern der Fläche pro Molekül (A m) des Blockcopolymers an der Grenzfläche geregelt.
Wir haben auf einem ursprünglichen, einzigartigen, gerüstfreie Gewebe-Engineering-Ansatz, Zellrasen Technik fokussiert, eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche verwenden. Die entwickelte Technologie wurde für verschiedene Organe 18 auf regenerative Therapien angewandt. Eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche wurde durch Pfropfen von Poly (N Isopropylacrylamid) (PIPAAm), eine temperaturempfindliche Molekül, auf eine Oberfläche 19-27 hergestellt. PIPAAm und seine Copolymere weisen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in wässrigem Medium bei Temperaturen nahe 32 ° C. Die Kulturfläche zeigte auch eine temperaturempfindliche Alterna auf zwischen Hydrophobie und Hydrophilie. Bei 37 ° C, die PIPAAm gepfropfte Oberfläche wurde hydrophob, und die Zellen leicht angebracht und proliferierten auf der Oberfläche als auch auf konventionelle Gewebskultur-Polystyrol. Wenn die Temperatur auf 20 ° C gesenkt wurde, wurde die Oberfläche hydrophil, und die Zellen von der Oberfläche spontan löst. Daher kultiviert konfluenten Zellen auf der Oberfläche konnte durch Änderung der Temperatur als intaktes Blatt geerntet werden. Diese Zell – Adhäsion und Ablösung Eigenschaften wurden auch von einer Oberfläche hergestellt durch Langmuir Filmbeschichtung für Labordemonstration 26 angezeigt, 27. Ein Langmuir – Film von Blockcopolymeren , bestehend aus Polystyrol (P (St)) und PIPAAm (St-IPAAm) wurde hergestellt. Die Langmuir – Film mit einem spezifischen A m könnte horizontal zu einer hydrophob modifizierten Glassubstrat übertragen werden. Zusätzlich Zelladhäsion auf und Ablösung von der vorbereiteten Oberfläche in Reaktion auf Temperatur wurden bewertet.
_content "> Hier beschreiben wir Protokolle für die Herstellung eines Films aus thermo-responsive amphiphile Blockcopolymere auf einem Glassubstrat besteht Langmuir nanostrukturiert. Unser Verfahren in verschiedenen Bereichen der Oberflächenwissenschaft eine effektive Herstellungstechnik für organische Nanofilme bereitstellen kann und erleichtern eine wirksame Kontrolle der Zelladhäsion auf und spontane Ablösung von einer Oberfläche.Protocol
Representative Results
Discussion
Eine temperaturempfindliche Oberfläche wurde durch das Langmuir-Schäfer-Methode hergestellt, und die Oberflächeneigenschaften für die Zelladhäsion / Ablösung und Zellrasen Rückgewinnung optimiert. Wenn für die Herstellung von Oberflächen unter Verwendung dieses Verfahrens sind mehrere Schritte kritisch. Die molekulare Zusammensetzung der St-IPAAm Moleküle hat eine große Wirkung auf die Oberflächenstruktur und die Stabilität der Oberfläche und durch die Erweiterung, auf die Zelladhäsion und Ablösung. Insb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program’s Project for Developing Innovation Systems “Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)” of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan.
Materials
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
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