En hurtigt Air-tør droppe kromosom fremstillingsmetode Egnet til FISH i planter
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Fremstilling af kromosomspredninger er en forudsætning for en vellykket udførelse af fluorescens in situ hybridisering (FISH). Fremstilling af høj kvalitet plante kromosomspredninger er udfordrende på grund af den stive cellevæg. En af de godkendte fremgangsmåder til fremstilling af vegetabilske kromosomer er et såkaldt drop præparat, også kendt som drop-spredning eller lufttørring teknik. Her præsenterer vi en protokol til hurtig tilberedning af mitotiske kromosom spreder egnet til FISH detektering af enkelt og høje kopi DNA-prober. Denne metode er en forbedret variant af den lufttørrede slip-metoden udføres under en relativ fugtighed på 50% -55%. Denne protokol omfatter et reduceret antal vasketrin gør dens anvendelse let, effektiv og reproducerbar. Åbenlyse fordele ved denne tilgang er godt spredt, ubeskadigede og talrige metafasekromosomer tjener som en perfekt forudsætning for en vellykket FISH-analyse. Ved hjælp af denne protokol vi opnået høj kvalitet kromosome spreads og reproducerbare FISH resultater for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Secale cereale.
Introduction
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er et effektivt redskab for den fysiske kortlægning af enkelt og høje kopi-sekvenser på det kromosomale niveau. Forudsætning er forberedelsen af høj kvalitet kromosom opslag. Der er ingen generel kromosom forberedelse protokol, som ville være lige så egnet til dyre- og planteceller. Tilberedning af vegetabilske kromosomer er særligt udfordrende på grund af den stive cellevæg og forskellige cytoplasma konsistens inden for forskellige arter. En af de gunstige fremgangsmåder til fremstilling af vegetabilske kromosomer er et såkaldt drop teknik også kendt som drop-spredningsteknik og lufttørring teknik 1,2. Denne metode blev først introduceret i 1958 af Rothfels og Siminovitch for dyrkede pattedyrceller in vitro 3. Senere Martin et al. 4 og Kato et al. 5 tilpasset denne metode til planter.
Mere for nylig, en fremgangsmåde kaldet 'SteamDrop &# 39; blev udviklet som anvendes vanddamp til fremstilling af ikke-overlappende kromosomer 6. Selv blev observeret den positive påvirkning af høj luftfugtighed tidligere 7, "SteamDrop 'leverer en kontrolleret arbejdsgang af høj kvalitet kromosom præparater 6. Dampen behandling forårsager strækning af kromosomer formentlig er forbundet med visse modifikationer af kromosomale proteiner. Kvaliteten af resulterende metafasespredninger er meget høj, selv om fastholdelse af tilstrækkeligt antal komplette metafasespredninger til efterfølgende FISH eksperimenter kræver teknisk ekspertise.
Her præsenterer vi en protokol til forberedelse af mitotiske korn kromosomer er egnede til FISH detektering af enkelt og høj kopi sonder 5,8. Denne metode er en forbedret variant af fremgangsmåden beskrevet af Kato 9 udføres under en relativ fugtighed på 50% -55% (figur 1) lufttørre nedkastning metode. Denne protokol omfatter et reduceret antalaf vasketrin gør dens anvendelse let, effektiv og reproducerbar. Ved hjælp af denne protokol vi opnåede høj kvalitet kromosom opslag og FISH resultater til Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Secale cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kromosom eksperimentforberedelsen er blevet udført under anvendelse af unge rødder korn tilhører græsfamilien (Poaceae). Alle analyserede arter har 14 forholdsvis lang mitotiske metafasekromosomer (11-15 um) i diploide genom sæt og tilhører store genom arter (5,1-7,9 GBP).
Længde af spiret rødder var ikke mere end 2 cm for at opnå maksimalt meristemvæv. Synkronisering af delende celler blev opnået ved en 20 timer lang isvand behandling, forbedret mængden af mitotiske metafasespre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy ‘SteamDrop’ method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
