Un air sec Chromosome Dropping rapide Méthode de préparation adéquate pour les poissons dans les usines
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Préparation des étalements de chromosomes est une condition préalable à l'exécution réussie de hybridation in situ en fluorescence (FISH). Préparation des chromosomes de la plante spreads de haute qualité est difficile en raison de la paroi cellulaire rigide. L'un des procédés approuvés pour la préparation des chromosomes de la plante est une préparation dite chute, également connu en tant que goutte d'étalement ou d'une technique de séchage par air. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation rapide du chromosome mitotique propage approprié pour la détection du poisson de sondes d'ADN copie unique et haute. Cette méthode est une variante améliorée de la méthode de la goutte sécher à l'air réalisée sous une humidité relative de 50% -55%. Ce protocole comprend un nombre réduit d'étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. Avantages évidents de cette approche sont bien étalées, chromosomes métaphasiques endommagées et de nombreux siégeant en tant que condition préalable idéale pour l'analyse FISH succès. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu chrome de haute qualitéOSOME spreads et les résultats de FISH reproductibles pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.
Introduction
Hybridation fluorescente in situ (FISH) est un outil efficace pour la cartographie physique des séquences à copie unique et élevés au niveau chromosomique. La condition préalable est la préparation du chromosome spreads de haute qualité. Il n'y a pas chromosome protocole général de préparation qui serait également approprié pour des cellules animales et végétales. Préparation des chromosomes de plantes est particulièrement difficile en raison de la paroi cellulaire rigide et divers de consistance à l'intérieur du cytoplasme des espèces différentes. L'un des procédés avantageux pour la préparation des chromosomes de la plante est une technique dite chute aussi connu comme technique d'étalement de goutte-et séchage à l'air technique 1,2. Cette méthode a été introduite en 1958 par Rothfels et Siminovitch pour in vitro des cellules de mammifères cultivées 3. Plus tard, Martin et al. 4 et Kato et al. 5 adapté cette méthode pour les plantes.
Plus récemment, une méthode nommée 'SteamDrop &N ° 39; a été développé qui utilise de la vapeur d'eau pour la préparation de chromosomes 6 ne se chevauchent pas. Bien que, l'influence positive de l'humidité élevée a été observée plus tôt 7, 'SteamDrop' délivre un flux contrôlé de chromosomes préparations de haute qualité 6. Le traitement à la vapeur provoque l'étirement des chromosomes probablement liées à des modifications des protéines chromosomiques. La qualité des spreads résultant de métaphase est très élevé, bien que retenue du nombre suffisant de métaphase complète propage pour des expériences de FISH ultérieures exige une expertise technique.
Nous présentons ici un protocole pour la préparation des chromosomes de céréales mitotiques appropriés pour la détection du poisson de sondes simples et copies élevé 5,8. Cette méthode est une variante perfectionnée du procédé de coulée sécher à l'air décrite par Kato 9 réalisé sous une humidité relative de 50% à 55% (Figure 1). Ce protocole comprend un nombre réduitdes étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu des étalements de chromosomes de haute qualité et les résultats de poisson pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'expérience de préparation du chromosome a été réalisée en utilisant jeunes racines de céréales appartenant à la famille des graminées (Poaceae). Toutes les espèces analysées ont 14 chromosomes métaphasiques relativement longue de la mitose (11-15 um) dans l'ensemble du génome diploïde et appartiennent à des espèces grand génome (05.01 à 07.09 GBP).
Longueur des racines germées était pas plus de 2 cm pour obtenir un maximum de tissu méristématique. La synchron…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
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