Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Herstellung von Chromosom-Spreads ist eine Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH). Herstellung von hochwertigen Pflanzenchromosom Spreads ist eine Herausforderung durch die starre Zellwand. Eine der anerkannten Methoden zur Herstellung von Pflanzenchromosomen ist eine so genannte Drop Zubereitung, die auch Drop Verstreuen oder lufttrocknende Technik bekannt. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die schnelle Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads für die FISH Nachweis einzelner und hohe Kopier DNA-Sonden. Dieses Verfahren ist eine verbesserte Variante des lufttrockenen Tropfenverfahren unter einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 55% durchgeführt. Dieses Protokoll besteht aus einer verringerten Anzahl von Waschschritten machte die Anwendung einfach, effizient und reproduzierbar. Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verbreitet, unbeschädigt und zahlreiche Metaphasechromosomen als eine perfekte Voraussetzung für eine erfolgreiche FISH-Analyse dient. Mit diesem Protokoll hochwertigen chrom wir erhaltenOsome Spreads und reproduzierbare FISH-Ergebnisse für Hordeum vulgäre, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale.
Introduction
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist ein effektives Werkzeug für die physische Zuordnung von Ein- und hohe Kopien Sequenzen an der chromosomalen Ebene. Voraussetzung ist die Herstellung von qualitativ hochwertigen Chromosomenspreads. Es gibt keine allgemeine Chromosomen Vorschrift, die gleichermaßen für die Tier- und Pflanzenzellen wären. Herstellung von Pflanzenchromosomen ist besonders herausfordernd aufgrund der starren Zellwand und Zellplasma verschiedener Konsistenz innerhalb verschiedener Arten. Einer der vorteilhaften Verfahren zur Herstellung von Pflanzenchromosomen ist eine sogenannte Drop-Technik auch als Drop Spreiztechnik und lufttrocknenden Technik 1,2 bekannt. Diese Methode wurde erstmals 1958 von Rothfels und Siminovitch für die in vitro gezüchtet Säugerzellen 3 eingeführt. Später Martin et al. 4 und Kato et al. 5 geeignet ist diese Methode für die Pflanzen.
In jüngerer Zeit ist ein Verfahren namens '& SteamDrop# 39; entwickelt, das Wasserdampf zur Herstellung von nicht überlappenden Chromosomen 6 verwendet. Zwar wurde der positive Einfluss der hohen Luftfeuchtigkeit früheren 7 beobachtet, 'SteamDrop' liefert eine gesteuerte Workflow von hochwertigen Chromosomenpräparate 6. Die Dampfbehandlung bewirkt Dehnung der Chromosomen wahrscheinlich zu einigen Änderungen der chromosomalen Proteinen verbunden. Die Qualität der resultierenden Metaphasespreitungen ist sehr hoch, obwohl der Halte ausreichende Anzahl von kompletten Metaphasespreitungen zur anschließenden FISH Experimente erfordert technisches Know-how.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Herstellung von Getreide mitotischen Chromosomen für die FISH Nachweis einzelner und hohe Kopier Sonden 5,8. Dieses Verfahren ist eine verbesserte Variante des von Kato 9 unter einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 55% durchgeführt (Abbildung 1) beschriebenen lufttrockenen Tropfverfahren. Dieses Protokoll eine reduzierte Anzahl umfasstder Waschschritte machen seine Anwendung einfach, effizient und reproduzierbar. Unter Verwendung dieses Protokolls erlangten hochwertigen Chromosomenspreads und FISH-Ergebnisse für Hordeum vulgäre, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Chromosom Vorbereitung Experiment wurde unter Verwendung von jungen Wurzeln von Getreide zu der Familie der Gräser (Poaceae) gehören, durchgeführt. Alle untersuchten Arten haben 14 relativ lange mitotischen Metaphase-Chromosomen (11-15 & mgr; m) in der diploiden Genom-Set und gehören zu großen Genom-Arten (5,1-7,9 GBP).
Länge der gekeimten Wurzeln nicht mehr als 2 cm, maximal Meristemgewebe erhalten. Synchronisation von sich teilenden Zellen wurde durch eine 20 Stunden lang Eis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
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