植物におけるFISHのための適切な高速空気乾燥滴下染色体製造方法
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
染色体スプレッドの調製は、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の成功した性能のための前提条件です。高品質の植物染色体スプレッドの調製により堅い細胞壁に困難です。植物染色体の調製のための承認された方法の一つは、いわゆるドロップ製剤、またドロップ拡散または空気乾燥技術として知られています。ここでは、有糸分裂染色体の高速製造のためのプロトコルは、シングルおよび高コピーDNAプローブのFISH検出に適し広がる提示します。この方法では、50％-55％の相対湿度下で行わ空気乾燥ドロップ方式の改良された変異体です。このプロトコルは、そのアプリケーションは、簡単に、効率的かつ再現可能な行う洗浄工程の数の減少を含みます。このアプローチの明白な利点は、成功したFISH分析に最適な前提条件となる損傷を受けていないと、多数の中期染色体よく普及しています。このプロトコルを用いて、我々は、高品質のCHROMを取得しましたオオムギ、Hのbulbosum、Hのmarinumの、Hのmurinum、Hのpubiflorumとライムギのためosomeスプレッドと再現性のFISH結果。
Introduction
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体レベルでのシングル、高コピー配列の物理的マッピングのための効果的なツールです。前提条件は、高品質の染色体スプレッドの調製です。動物および植物細胞にも同様に適しているであろう全く一般的な染色体調製プロトコルはありません。植物染色体の調製により堅い細胞壁と異なる種内の様々な細胞質の一貫性に特に困難です。植物染色体の調製のための有利な方法の一つは、また、ドロップ拡散技術、空気乾燥技術1,2として知られる、いわゆるドロップ技術です。この方法は、まずin vitroで増殖させた哺乳動物細胞の3のためロートフェルスとSiminovitchによって1958年に導入されました。その後、マーティンら 4と 加藤ら 5は、植物のため、この方法を適応しました。
最近では、メソッドの名前」SteamDrop＆＃39;非重複染色体6の製造のための水の蒸気を使用する開発されました。 、高湿度の正の影響が早く7観察されたが、「SteamDropは「高品質の染色体標本6の制御されたワークフローを提供します。蒸気処理は、おそらく染色体タンパク質のいくつかの修正に接続染色体の伸びが発生します。完全な中期の十分な数の保持、その後のFISH実験に広がるものの、中期スプレッドを結果の品質が非常に高く、技術的な専門知識を必要とします。
ここでは、単一および高コピープローブ5,8のFISH検出に適し分裂穀物染色体の調製のためのプロトコルを提示します。この方法は、加藤50％-55％の相対湿度下で行わ9（ 図1）によって記載され空気乾燥滴下法の改良された変異体です。このプロトコルは、削減された数を含み、そのアプリケーションは、簡単に、効率的かつ再現可能な行う洗浄工程の。このプロトコルを用いて、我々は、 オオムギ、Hのbulbosum、Hのmarinumの、Hのmurinum、Hのpubiflorumとライムギのための高品質の染色体スプレッドおよびFISHの結果を得ました。
Protocol
Representative Results
Discussion
染色体の調製実験は、イネ科（イネ科）に属している穀物の若い根を使用して行われています。すべての分析種は、二倍体ゲノムセットで14比較的長い分裂中期染色体（11-15μm）を持っており、大規模なゲノム種（5.1から7.9ポンド）に帰属します。
発芽根の長さは、分裂組織の最大値を得るために、2cm以上ではなかったです。分裂細胞の同期化は、分裂中期の量が10を…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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