En Rask Air-tørr slippe Chromosome Forberedelse Metode Passer for FISH i Plants
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Utarbeidelse av kromosom sprer er en forutsetning for en vellykket gjennomføring av fluorescens in situ hybridisering (FISH). Fremstilling av høykvalitets plantekromosom sprer er utfordrende på grunn av den stive celleveggen. En av de godkjente metoder for fremstilling av plantekromosomer er en såkalt slipp-preparatet, også kjent som rulle spredning eller lufttørkende teknikk. Her presenterer vi en protokoll for rask tilberedning av mitotisk kromosom sprer egnet for FISH påvisning av single og høye kopi DNA-prober. Denne fremgangsmåte er en forbedret variant av den lufttørke slipp-metoden utføres under en relativ fuktighet på 50% -55%. Denne protokollen består av et redusert antall vasketrinn som gjør dens anvendelse enkel, effektiv og reproduserbar. Åpenbare fordeler ved denne tilnærmingen er godt spredt, uskadde og mange metafase kromosomer fungerer som en perfekt forutsetning for vellykket FISH analyse. Ved hjelp av denne protokollen vi oppnådd høy kvalitet kromOSOME sprer og reproduserbare FISH resultater for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Rug cereale.
Introduction
Fluorescens de situ hybridisering (FISH) er et effektivt verktøy for kartlegging av fysiske enkelt- og høye kopisekvenser ved kromosomal nivå. Forutsetning er utarbeidelsen av høy kvalitet kromosom oppslag. Det er ingen generell kromosom forberedelse protokoll som ville være like egnet for dyre- og planteceller. Utarbeidelse av plante kromosomer er spesielt utfordrende på grunn av den stive celleveggen og ulike cytoplasma konsistens innenfor ulike arter. Et av de fordelaktige metoder for fremstilling av plantekromosomer er en såkalt slipp også kjent som drop-spredningsteknikk og luft-tørking 1,2 teknikk. Denne metoden ble først introdusert i 1958 av Rothfels og Siminovitch for in vitro dyrkede pattedyrceller 3. Senere Martin et al. 4 og Kato et al. 5 er tilpasset denne fremgangsmåte for planter.
Flere nylig, en metode kalt "SteamDrop &# 39; ble utviklet som anvendt vanndamp for fremstilling av ikke-overlappende kromosomer 6. Selv ble positiv påvirkning av høy luftfuktighet observert tidligere 7, 'SteamDrop' leverer en styrt arbeidsflyt høykvalitets kromosompreparater 6. Dampbehandling fører til strekking av kromosomer trolig koblet til noen endringer av kromosom proteiner. Kvaliteten resulterende metafase sprer er meget høy, selv om fastsetting av tilstrekkelig antall kompmeta sprer seg for etterfølgende eksperimenter FISH krever teknisk ekspertise.
Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse av mitotiske korn kromosomer egnet for FISH påvisning av single og høy kopi sonder 5,8. Denne fremgangsmåte er en forbedret variant av den lufttørke dråpemetoden er beskrevet av Kato 9 utføres under relativ fuktighet på 50% -55% (figur 1). Denne protokollen består av et redusert antallav vasketrinn gjør sin søknad enkel, effektiv og reproduserbar. Ved hjelp av denne protokollen vi oppnådd høy kvalitet kromosom sprer og FISH resultater for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Rug cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kromosomet preparatet Forsøket er blitt utført ved hjelp av små røtter av korn som tilhører gressfamilien (Poaceae). Alle artene har 14 relativt lang mitotiske metafase kromosomer (11-15 mikrometer) i diploid genomet sett og tilhører storgenom arter (05.01 til 07.09 GBP).
Lengden av spirede røttene var ikke mer enn 2 cm for å oppnå et maksimalt meristematic vev. Synkronisering av delende celler ble oppnådd ved en 20 timer lang isvann behandling som forbedret mengde av mitotiske met…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy ‘SteamDrop’ method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
