Быстрый воздушно-сухой Падение Хромосома Способ получения Подходит для рыбы у растений
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Подготовка спредов хромосом является необходимым условием для успешного выполнения флуоресценции в гибридизация (FISH). Подготовка высококачественных спредов завод хромосом является сложной задачей из-за жесткой клеточной стенки. Одним из одобренных способов получения растительных хромосом является так называемая подготовка падение, также известный как капли распространяющихся или техники сушки на воздухе. Здесь мы представляем протокол для быстрого приготовления митотического хромосомы распространяется подходит для обнаружения рыбы одиночных и высоких копий ДНК-зондов. Этот метод представляет собой усовершенствованный вариант воздушно-сухого капельным методом осуществляют при относительной влажности 50% -55%. Этот протокол включает в себя уменьшение количества стадий промывки делает его применение просто, эффективно и воспроизводимым. Очевидные преимущества такого подхода хорошо распространение, неповрежденные и многочисленные хромосомы метафазные, выступающей в качестве идеального предпосылки для успешного анализа FISH. Используя этот протокол, мы получили качественный хромosome спреды и воспроизводимые результаты рыбу для Hordeum обыкновенной, Х. Х. луковичный, Маринум, Х. Х. murinum, pubiflorum и Secale Cereale.
Introduction
Флуоресценции в гибридизация (FISH) является эффективным инструментом для физического картирования отдельных и высоких последовательностей копирования на хромосомном уровне. Обязательным условием является подготовка спредов хромосомных высокого качества. Там нет общего протокола подготовки хромосом, которые в равной степени подходит для животных и растительных клеток. Приготовление растительных хромосом особенно трудно из-за жесткой клеточной стенки и различных консистенции цитоплазмы в различных видов. Одним из выгодных методов получения растительных хромосом является так называемая технология падение также известен как раскрывающегося распространение техники и сушки на воздухе 1,2 техники. Этот метод был впервые введен в 1958 году и Ротфельс Siminovitch для в пробирке выращенных клетках млекопитающих 3. Позже Мартин и др. 4 и Като и др. 5 приспособлен этот метод для растений.
Совсем недавно, метод назван "SteamDrop &# 39; был разработан, которые используются водяной пар для приготовления неперекрывающихся хромосом 6. Хотя, положительное влияние высокой влажности наблюдалось ранее 7, "SteamDrop" поставляет контролируемый технологический процесс препаратов 6 высококачественных хромосом. Обработку паром вызывает растяжение хромосом, вероятно, подключенных к некоторыми изменениями хромосомных белков. Качество результате метафазных очень высока, хотя стопорное достаточного количества полной метафазных для последующих экспериментов FISH требует технических знаний.
Здесь мы приводим протокол для подготовки митотических хромосом зерновых, пригодных для обнаружения рыбы одиночных и высокий экземпляр зондов 5,8. Этот метод представляет собой усовершенствованный вариант воздушно-сухого метода, описанного капельной Като 9 выполняется под относительной влажности 50% -55% (рисунок 1). Этот протокол включает в себя уменьшение количествашагов стиральных делает его применение просто, эффективно и воспроизводимым. Используя этот протокол, мы получили высокие качества спредов хромосом и результаты рыбу для Hordeum обыкновенной, Х. Х. луковичный, Маринум, Х. Х. murinum, pubiflorum и Secale Cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эксперимент подготовка хромосома была проведена с помощью молодых корней зерновых, принадлежащих к семейству травы (Poaceae). Все анализируемые виды имеют 14 относительно длинный митотических хромосом (метафазных 11-15 мкм) в диплоидным набором генома и принадлежат большого генома видов (5.1-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy ‘SteamDrop’ method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
