Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Preparación de extensiones de cromosomas es un requisito previo para el buen desarrollo de la hibridación in situ fluorescente (FISH). Preparación de alta calidad extensiones de cromosomas planta es un reto debido a la pared celular rígida. Uno de los métodos aprobados para la preparación de cromosomas de la planta es una preparación gota llamada, también conocido como gota de dispersión o la técnica de secado al aire. A continuación, presentamos un protocolo para la preparación rápida del cromosoma mitótico extiende adecuado para la detección FISH de sondas de ADN individuales y altos de copia. Este método es una variante mejorada del método de la gota de secado al aire se realiza bajo una humedad relativa de 50% -55%. Este protocolo se compone de un número reducido de etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. Obvios beneficios de este enfoque son bien extendidas, metafase los cromosomas intactos y numerosos que sirven como requisito previo perfecto para el análisis FISH éxito. El uso de este protocolo se obtuvo chrom de alta calidadOsome márgenes y resultados de FISH reproducibles para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.
Introduction
Hibridación in situ fluorescente (FISH) es una herramienta eficaz para el mapeo físico de las secuencias de copia única y altas a nivel cromosómico. Requisito previo es la preparación de extensiones de cromosomas de alta calidad. No hay cromosoma protocolo general de preparación que sería igualmente adecuado para células animales y vegetales. Preparación de cromosomas de la planta es particularmente difícil debido a la pared celular rígida y varios consistencia citoplasma dentro de diferentes especies. Uno de los métodos favorables para la preparación de cromosomas de la planta es una técnica de caída de llamada también conocida como técnica de la gota de dispersión y secado al aire técnica de 1,2. Este método fue introducido por primera vez en 1958 por Rothfels y Siminovitch para in vitro células de mamíferos cultivadas 3. Más tarde Martin et al., 4 y Kato et al. 5 adaptó este método para las plantas.
Más recientemente, un método llamado 'SteamDrop y# 39; fue desarrollado que utiliza vapor de agua para la preparación de cromosomas que no se solapan 6. Aunque, se observó la influencia positiva de la alta humedad anterior 7, 'SteamDrop' ofrece un flujo de trabajo controlado de preparaciones de cromosomas de alta calidad 6. El tratamiento de vapor provoca el estiramiento de los cromosomas probablemente conectados a algunas modificaciones de las proteínas cromosómicas. La calidad de los diferenciales de metafase resultante es muy alta, aunque de retención de número suficiente de metafase completa se extiende para posteriores experimentos de FISH exige conocimientos técnicos.
Aquí se presenta un protocolo para la preparación de los cromosomas mitóticos cereales adecuados para la detección de sondas FISH individuales y alta copia 5,8. Este método es una variante mejorada del método de goteo se seque al aire descrito por Kato 9 realizado bajo una humedad relativa de 50% -55% (Figura 1). Este protocolo comprende un número reducidode etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. El uso de este protocolo se obtuvieron extensiones de cromosomas de alta calidad y los resultados de FISH para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
El experimento preparación cromosoma se ha llevado a cabo utilizando las raíces jóvenes de cereales pertenecientes a la familia de las gramíneas (Poaceae). Todas las especies analizadas tienen 14 cromosomas en metafase relativamente largo mitótico (11 a 15 micras) en el conjunto del genoma diploide y pertenecen a especies de gran genoma (05.01 a 07.09 GBP).
Longitud de raíces germinadas no era más de 2 cm para obtener un máximo de tejido meristemático. La sincronización de las cél…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
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