Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Kromozom yayılır hazırlanması floresan in situ hibridizasyon başarılı performansı (FISH) için bir ön koşuldur. Yüksek kaliteli bitki kromozom yayılır hazırlanması nedeniyle sert hücre duvarına zordur. Bitki kromozomlarına hazırlanması için onaylanmış yöntemlerden biri olarak adlandırılan bir damla hazırlanması da damla yayılan ya da hava-kurutma tekniği olarak bilinmektedir. Burada, mitotik kromozom hızlı hazırlanması için bir protokol tek ve yüksek kopya DNA probları BALIK tespiti için uygundur yayılır sunuyoruz. Bu yöntem, 50% -55% arasında bağıl nem altında gerçekleştirilen havada kuru damla yöntemin geliştirilmiş bir varyantıdır. Bu protokol, uygulama, kolay, verimli ve tekrarlanabilir hale yıkama aşamaları, daha az sayıda içerir. Bu yaklaşımın bariz faydaları başarılı FISH analizi için mükemmel bir önkoşul olarak hizmet veren iyi yayılmış, hasarsız ve çok sayıda metafaz kromozomları vardır. Bu protokolü kullanarak yüksek kaliteli chrom eldeosome yayılır ve Hordeum vulgare H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale'den için tekrarlanabilir FISH sonuçları.
Introduction
In situ hibridizasyon (FISH) Floresan kromozom düzeyinde tek ve yüksek kopya dizilerinin fiziksel haritalama için etkili bir araçtır. Koşul, yüksek kaliteli kromozom yayılımlarının hazırlanmasıdır. Hayvan ve bitki hücreleri için aynı derecede uygun olacaktır genel kromozom hazırlama protokolü vardır. Bitki kromozomların hazırlanması nedeniyle farklı türlerin içinde sert hücre duvarı ve çeşitli sitoplazma kıvamına özellikle zordur. Bitki kromozom hazırlanması için olan uygun yöntemlerden biri de damla yayılan tekniği ve hava-kurutma tekniği 1,2 olarak bilinen olarak adlandırılan bir damla bir tekniktir. Bu yöntem ilk olarak, in vitro yetiştirilen memeli hücrelerinin 3 Rothfels ve Siminovitch tarafından 1958 yılında tanıtıldı. Daha sonra Martin ve ark. 4 ve Kato ve diğ. 5 bitkiler için bu yöntemi uyarlanmıştır.
Daha yakın zamanlarda, adlı bir yöntem 'SteamDrop ve# 39; örtüşmeyen kromozom 6 hazırlanması için kullanılan su buharına geliştirildi. , Yüksek nem olumlu etkisi daha erken 7 gözlenmesine rağmen, 'SteamDrop' yüksek kaliteli kromozom hazırlıkları 6 kontrollü bir iş akışı sağlar. Buhar tedavi muhtemelen kromozomal proteinler, bazı değişikliklere bağlı kromozomların gerilmesine neden olur. Tam metafaz yeterli sayıda tutma sonraki FISH deneyler için teknik uzmanlık gerektirir yayılır rağmen metafazlarda sonuçlanan kalitesi çok yüksektir.
Burada tek ve yüksek kopya probları 5,8 FISH tespiti için uygun mitotik tahıl kromozom hazırlanması için bir protokol mevcut. Bu yöntem, Kato 50% -55% bağıl nem altında gerçekleştirilir 9 (Şekil 1) tarafından tarif havada kuru damlatma yöntemi geliştirilmiş bir varyantıdır. Bu protokol daha az sayıda içerenuygulaması kolay, verimli ve tekrarlanabilir hale yıkama adımları. Biz Hordeum vulgare H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale'den için yüksek kaliteli kromozom yayılır ve FISH sonuçları elde bu protokolü kullanarak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kromozom, hazırlanışı deney ot familyasının (Poaceae) ait olan hububat genç kökleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm analiz türler diploid genom sette 14 nispeten uzun mitotik metafaz kromozomları (11-15 mikron) ve büyük genom türlerinin (5,1-7,9 Sterlin) aittir.
Çimlenmiş köklerinin uzunluğu meristematik doku maksimum elde etmek için en fazla 2 cm değildi. Bölünen hücrelerin eşitleme mitotik metafaz miktarı 10 yayılır geliştirilmiş bir 20 sa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy ‘SteamDrop’ method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
