Akış Sütun Perde: Verimliliği ve Duyarlılık Optimizasyonu
Summary
Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.
Abstract
Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.
Introduction
Son yıllarda Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) için kolon teknolojisi çok gelişmiş olan; zirve kapasiteleri büyük ölçüde küçük parçacık boyutlarının kullanılması ve daha verimli çekirdek kabuk parçacıklarına ölçüde sayesinde artmıştır. Ayrılmalar genellikle daha verimli olduğundan zirveleri artık daha keskin ve 1-8 dolayısıyla uzun boylu, çünkü bir akış üzerindeki etkisi duyarlılığında bir artış olmuştur.
Bununla birlikte, radyal yatak heterojenlik tüm sütunlara performansında bir sınırlayıcı faktör hala, ama bu chromatographers yıllardır bu bilinen beri yeni bir hikaye değil. Sütun yatak radyal yönde 9-12 hem heterojen olup, 10,12-15 eksen sütun boyunca. Duvar etkisi özellikle ayırım performansı 7,16-18 kaybı önemli bir katkıda bulunuyor. Shalliker ve Ritchie 7 geçenlerde sütun yatak heterojenite yönlerini gözden geçirilmiş ve dolayısıyla bu Tartışılan olması gerekmezd burada daha. Kâfi demek olsa da, sütun yatak ambalaj yoğunluğu değişim ve duvar etkileri bantları kısmen çorba dolu andı- fişleri sütun aracılığıyla Zehir şekilde çözünen fişin bir bozulma, neden bu oldukça olan ince düz katı diskler 7 den çanaklar genellikle temel öğretim metinlerinde tasvir. Deneyler yatağı boyunca çözünen göç görüntülenmiştir ki böyle yapılmıştır zaman sütun içinde fiş profilleri kısmen boş ve bandın atık bölümü büyük ölçüde örnek fiş duvar bileşenidir. Sonuçta bu diskler, katı ve 12,14,17 düz olsaydı gerekli olandan bu 'kısmen boş' fişleri ayırmak için çok daha fazla tabak almasıdır. Duvar etkileri ve radyal ambalaj yoğunluğu varyasyon ile ilişkili sorunların genişleten grup üstesinden gelmek için, Aktif Akış Teknolojisi (AFT) olarak bilinen kolon teknolojisinin yeni bir form 7,19 tasarlanmıştır. Bu tasarımın amacı neydisütunun 19 radyal merkezi bölgesinde akıtılarak mobil fazın böyle olduğunu, duvar bölge boyunca çözücü salgılayan fiziksel ayırma yoluyla duvar etkilerini ortadan kaldırmak için. AFT sütunların iki ana türü vardır; Paralel Segment Akış (PSF) sütunlar ve Perde Akışı (CF) kolonlar 7. Bu protokol CF kolonların kullanımı ve optimizasyon amaçlı olduğundan, PSF sütunları daha ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır.
Perde Akış (CF)
Perde Akış (CF) sütun biçimleri giriş ve sütunun çıkışında hem de AFT son parçaları kullanmaktadır. AFT sonu ekleri bir çok portlu montaj içinde bulunan bir dairesel frit oluşur. Frit üç kısımdan oluşur: bağlantı ucunun orta noktasına, uç teçhizat çevresel bağlantı (lar) ile aynı hizada olan bir gözenekli dış kısmı ve su geçirmez bir halka ile hizalı olan bir gözenekli, radyal merkezi kısım olduğu herhangi bir çapraz engelleyen iki gözenekli kısımları ayıran. frit 19 radyal merkezi ve dış bölgeleri arasındaki akışı ile 1 AFT frit tasarımını göstermektedir ve Şekil 2 CF sütun biçiminde göstermektedir. ek mobil faz, radyal merkezi bölgesi ile eriyiklerin göçü 'perde' girişine çevresel bağlantı noktası üzerinden sokulur iken bu operasyon modu (CF), numune, Ek giriş radyal merkezi bağlantı noktasına enjekte edilir sütun. Bu nedenle örnek, yalnızca geçtiği mobil faza sahip kolonun dış bölge sütunun radyal orta bölgesinde bir yatak girer. (: Periferik bağlantı noktası merkez) 4.6 mm iç çapı (id) kolonu uç parçası girişi için uygun 6,7,16 olan çalışmalar yaklaşık 40:60 bir hacimsel akış hızı oranı göstermiştir. CF sütun kıç çıkışı göreceli kısmına merkezi ve çevresel akışın ayarına izin verir ve hemen hemen arzu edilen herhangi bir Rati için değişik olabilirbasınç yönetimi o. Bir CF sütunun optimizasyonu önemli ölçüde bu tür ayırma verimliliği veya algılama hassasiyeti gibi kolon teknolojisinin çeşitli fonksiyonel yönlerini artırabilir. Bu şekilde, bir "duvara az", "sonsuz çapı" ya da "sanal" sütunu 6,10,18,20 kurulur. CF sütun amacı aktif duvar bölgesine ulaşma numunenin önlemek için kolon boyunca numunenin taşıma yönetmektir. Böylece, dedektöre çıkış üzerine çözünen konsantrasyonu Ultraviyole (UV) algılama 16 kullanırken ve hatta kitle spektral algılama 6 kullanarak daha zaman geleneksel kolon biçiminden daha yaklaşık 2,5 kat daha fazladır duyarlılığını artırarak, maksimize edilir.
algılama hassasiyeti artar beri CF sütunlar ideal düşük konsantrasyon numuneler için uygundur. Bu kütle spektrometresi (MS), 6 olarak hızlı sınırlı dedektörler, akış eşlendiğinde Dahası, idealdir. bir AÖrneğin bir 4.6 mm kimliği biçiminde FT kolon,% 21 orta akışını çıkan ayarlayarak, aynı doğrusal hızlarda çalıştırıldığında, standart 2.1 mm id biçimi sütunu olarak bir dedektörün çözücünün aynı hacimde teslim ayarlanmış olabilir. Aynı şekilde AFT sütun da% 43'e merkezi akışını çıkan ayarlayarak, bir 3.0 mm id sütunu olarak bir dedektörün aynı hacim yükü teslim ayarlı olabilir. Aslında, herhangi "sanal" sütun biçimi analitik gereksinimi 6,18,22 göre üretilebilir. Girişte bu özel olarak tasarlanmış son parçaları kullanarak ve çıkış gerçek bir duvar daha az sütun kurulmuş olmasını sağlar.
Girişin santral ve periferik limanlarına solvent dağıtım sistemi kurmak için iki yol vardır:. Split akış sistemi 6 ve iki pompa sistemi 6,7 3 bu CF sistemi set up her göstermektedir Şekil.
Split-akış sistemi
benna bölünmüş akış sistemi (Şekil 3A) enjektör giden pompa akışı mobil faz bir akış akışı daha sonra bağlanır enjektörüne bağlı bir sıfır ölü hacim T-parçası ile bölünmüş ön enjektörün sütunun giriş sonu montaj merkezi bağlantı noktası. Mobil fazın ikinci akış akışı enjektör by-pass ve sütun girişine çevresel bağlantı noktasına bağlıdır. Merkezi ve periferik için pompa enjektörden, çizgiler kolonuna bağlanmadan önce, yani: akış bölme sırasında, akım akışı oranı 40:60 (çevresel merkezi) ayarlanır.
İki pompa sistemi
CF sütun sütun giriş sonu uydurma iki akış akışı gerektirir. Ayarlamak HPLC aleti, bölünmüş akış otomatik örnekleyici / enjektör türüne bağlı olarak mümkün olmayabilir ve bu nedenle KF sonra 2 pompa (Şekil 3B 21) ile elde edilebilir. Her pompa ayrılan ve merkezi ya da periferal bağlantı ve akış hızı, merkezi bağlantı noktası için akış% 40 ve periferik bağlantı noktası için% 60 temsil etmek üzere ayarlanır, ya bağlanır. Toplam akış oranı 1.0 ml dk-1 ise, örneğin, merkezi bir pompa akış hızı, 0.4 ml min ayarlanır -1 ve periferik pompası 0.6 ml dk -1 ayarlanır.
çalışma modu seçimi HPLC enstrümantasyon ve operasyon kromatografik modunda büyük ölçüde bağlıdır. Örnek yük konumu ve numune arasındaki basınç değişikliği pozisyon bölünmüş akış oranını bozan oluşabilir ve böylece bu durumda kurmak çift pompa optimum CF performans için önerilen olacağını enjekte bazı otomatik numune alma cihazı Örneğin. Ne olursa olsun CF sütunun girişi için seçilen kurmak solvent dağıtım sistemi, CF çıkış optimizasyonu aynı kalır. CF sütunun çıkış merkezi liman Smal ile Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) dedektör bağlı olduğuHortumun olası hacmi diye post-kolon ölü hacim etkilerini en aza indirmek için. CF sütunlar dar delik sütunlar taklit beri, kolon çıkışına ve dedektör arasındaki ölü hacim CF sütunun ayırma performansı için zararlıdır. Merkez liman ve böyle verimlilik ve hassasiyet band genişletilmesi, kayıp olarak ölü hacim etkilerini en aza indirmek için UV-Vis dedektör arasındaki boru hacminin küçük miktarda sağlamak için kritik öneme sahiptir. Dolayısıyla, dar delik boru (0.1 mm id) kullanımı kolay uygunsuz ölü hacim eklemeden basınç ayarlamaları izin tavsiye edilir. Boru, aynı zamanda periferal noktasına bağlanır ve atık yöneliktir. CF sütunun çıkışma üzerine bölütleme oranı analisti amaca uygun herhangi bir orana ayarlanabilir. 4.6 mm id CF kullanıldığında, örneğin, ya 43:57 ya 21:79 (merkezi: periferik) olarak oranını ayarlamak için sık sık uygun bir 'sanal' 3,0 mm id sütunu veya 2.1 mm id sütunu taklit,saygıyla. Bu şekilde ayırma performansı kolayca tezgah işaretlenmiş olduğunu. segmentasyon oranı merkez bağlantı noktasına bağlı ve bir dönem zamanla çevresel port çıkan akış olduğunu dedektör çıkan akış miktarını tartılması ile ölçülür. Her bir bağlantı noktası üzerinden yüzde akışı daha sonra tespit edilebilir ve oranlar tüpüne eklenmiş uzunluğunu değiştirerek ya da başka bir iç çapa (id) sahip olan boru sistemi kullanılarak ayarlanabilir.
Bu video protokolü gelişmiş kromatografik performans için CF kolonun çalışma ve optimizasyon prosedürleri ayrıntıları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma verimliliği ve duyarlılık açısından analitik performansını test etmek için CF kromatografi kolonlarının laboratuvarlar arası analizini içeriyordu. 3 'kısmında tarif edildiği gibi CF kolonu ikili pompa sistemi ile oluşturulmuştur. (: Periferik merkezi) CF sütunun girişine çift pompa sistemi 40:60 akış oranını elde etmek için 'kurdu. 40:60 (merkez: Periferik) akış oranı, sırasıyla,% 40 ve toplam akış hızının% 60 temsil değeri her bir pompanın akış oranının ay…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305, 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335, 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122, 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262, 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography (‘the infinite diameter column’) with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110, 127-132 (2013).
