In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Det ryggradsdjur nervsystemet utträder från neurala plattan som ett homogent skikt av neuroepitelceller. Att förstå hur utvecklingsprogram induceras, kodas, och etablerades under regionalisering av neurala plattan är för närvarande ett viktigt mål i utvecklingsbiologi. Jämfört med andra system, är den experimentellt mottaglig Xenopus embryo en modell av val för att analysera tidiga stegen av neural utveckling 1,2. Det är lätt att få ett stort antal embryon, och extern utveckling ger tillgång till de allra första stegen i neurulation 3. Många verktyg är tillgängliga för att experimentellt manipulera Xenopus laevis (X laevis) embryonal utveckling. Mikroinjektion av mRNA eller morpholinos (MO), inklusive inducerbara MO, tillsammans med biokemiska och farmakologiska verktyg, möjliggör kontrollerat funktionsökning (GOF) och förlust av funktion (LOF) och specifik förändring av signalvägar 4,5. Blastocoel tak ektoderm, ligger runt djuret polen i en blastula eller en mycket tidig gastrula embryo, och kallas "Animal Cap" (AC), är en källa av pluripotenta celler som kan programmeras genom manipulation av genuttryck före Explantat beredning. I detta manuskript är detaljerade protokoll att använda X. laevis AC explants att testa de vitro och in vivo molekylära mekanismer och cellulära processer som ligger bakom neurala utveckling.
En teknik presenteras, vilket gör fina observation av genexpressionsmönster i en Xenopus grodyngel neuralrörsdefekter, ett första steg i fastställandet av ödet bestämnings ledtrådar. Medan observationen av platta monterade vävnader används vanligen i studien av kycklingembryon 6, har det inte blivit korrekt beskrivits i Xenopus. Manipulering av genuttryck genom att injicera syntetisk mRNA eller MO i blastomerer av 2 eller 4 cell skede embryon tillåter programmering av ACExplantat 4. Exempelvis hämning av benmorfogenetiskt protein (BMP) -vägen genom uttryck av anti-BMP-faktor Noggin, ger en neural identitet till AC-celler 3. Protokollet specificeras för utförande lokal och tidsstyrt exponering av växelströms explantat till extrinsiska ledtrådar via direkt kontakt med ett anjonbytarharts pärla. Äntligen en teknik beskrivs för att testa utvecklings egenskaper hos neurala stamceller in vivo genom transplantation av blandade explantat framställda från olika programmerade celler dissocierade och åter associerade.
Grodan embryo är en kraftfull modell för att studera tidiga ryggradsdjur neural utveckling. Kombinera manipulation av genuttryck till explantation in vitro kulturer ger viktig information i studiet av neuroepithelium regionalisering, spridning och morfogenes 7-12. Programmeringen av AC explants tillåtet utvecklingen av en fungerande hjärta ex vivo 13,14. Användningenav Explantation ympning 15 ledde till identifieringen av den minimala transkriptions omkopplaren inducerar neurallisten differentieringsprogram 16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) är en signalering som utsöndrar sonic hedgehog (Shh) för att kontrollera tillväxten och regionaliseringen av den kaudala framhjärnan. När löpande utsatt för Shh, neuro celler samuttrycker de tre transkriptionsfaktorgener – barH liknande homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) och Iroquois-3 (irx3) – förvärvar två egenskaper hos ZLI facket: befogenhet att uttrycka shh, och förmågan att segregera från främre neurala plattceller. Som modellsystem, kommer induktion av en ZLI öde i neuro celler presenteras 8.
Dessa protokoll syftar till att ge enkla, billiga och effektiva verktyg för utvecklingsbiologer och andra forskare att utforska den grundläggande mechanisms av viktiga nervcells beteenden. Dessa protokoll är mycket mångsidig och tillåter undersökning av ett stort utbud av yttre och inre neurala bestämnings ledtrådar. Det tillåter långsiktigt in vivo analys av neurala härstamning engagemang, induktiva interaktioner och cell beteenden.
Neural utveckling iscensatt av ett komplext samspel mellan cellulära utvecklingsprogram och signaler från de omgivande vävnaderna (Omdömet på 3,31,32). Här beskriver vi en uppsättning protokoll som kan användas i X. laevis embryon att utforska yttre och inre faktorer som neurala öde beslutsamhet och neurala morfogenes de vitro och in vivo. Dessa protokoll kan användas som sådan på X. tropic embryon emellertid X. tropic embryon är fyra…
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |