मलीय Glucocorticoid विश्लेषण: Equids में गैर-आक्रामक अधिवृक्क निगरानी
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
विधि वर्णित उद्देश्य आदेश अधिवृक्क गतिविधि का एक गैर-आक्रामक मूल्यांकन प्रदान करने के लिए घोड़े का मल में corticosterone सांद्रता का विश्लेषण करने के लिए। मापने हाईपोथेलेमिक पिट्यूटरी-अधिवृक्क (एचपीए) अक्ष गतिविधि दोनों बंदी और घरेलू प्रजातियों में संभावित प्रतिकूल स्थितियों पर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक स्वीकृत दृष्टिकोण है। संदर्भ तकनीक और सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि हालांकि, इस तरह मल विश्लेषण के रूप में वैकल्पिक तरीकों का आदेश तनाव रक्त नमूने स्वयं के द्वारा प्रेरित दूर करने और मुक्त करने के लिए लेकर प्रजातियों की निगरानी करने की क्षमता अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है रक्त प्लाज्मा 1 का इस्तेमाल होता है।
एक प्रतिकूल स्थिति के दौरान, शारीरिक homeostasis बाधित है। रिहा हार्मोन (CRH) जो पूर्वकाल पिट्यूटरी ग्रंथि पर कार्य करता है और adrenocorticotrophic हार्मोन (ACTH) की रिहाई को बढ़ावा corticotrophin मस्तिष्क विज्ञप्ति में हाइपोथेलेमस। ACTH खून में प्रवेश करती है और नकदी छिपाना अधिवृक्क प्रांतस्था को उत्तेजित करता हैविशिष्ट glucocorticoids (जीसी)। Glucocorticoids बारीकी बजाय लगातार सभी ऊर्जा बढ़ राज्यों इसलिए वे अक्सर अन्य तनाव से जुड़े हार्मोन पर 2 वरीयता में मापा जाता है में उत्पादन किया जा रहा तनाव की घटनाओं से जुड़ी हैं। Glucocorticoids घोड़ों में कई अनुकूली प्रभाव के लिए जिम्मेदार हैं। ऊर्जा तेजी से फैटी एसिड और ग्लूकोज के रूप में शरीर में भंडारण साइटों से जुटाए है, ऑक्सीजन की मात्रा बढ़ जाती है, संवेदी समारोह 3 बढ़ाया है और रक्त प्रवाह आंदोलन 4 के लिए आवश्यक नहीं क्षेत्रों के लिए कम हो जाती है। साथ ही एक मुकाबला तंत्र के रूप में काम कर के रूप में, Glucocorticoids में तनाव प्रेरित वृद्धि भी अगले तनाव 5 के लिए पशु तैयार करने में मदद कर सकता है।
प्लाज्मा में हार्मोन का स्तर और लार का आकलन हालांकि वास्तविक घूम हार्मोन को मापने, हार्मोन के चयापचय अंत उत्पाद मल उपायों में चयापचयों मापने शामिल है। परिसंचारी स्टेरॉयड एल में catabolized रहे हैंपित्त, जहां वे आंतों 6 ट्रैक के भीतर बैक्टीरिया वनस्पति के enzymatic गतिविधियों द्वारा सुविधा आगे के परिवर्तन से गुजरना करने में उत्सर्जन से पहले iver। इसलिए, रक्त glucocorticoids की ओर निर्देशित immunoassays मल glucocorticoid चयापचयों 7 के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता।
के रूप में मल संग्रह घोड़े के लिए कोई अशांति के साथ किया जा सकता है, corticosterone के लिए मल का विश्लेषण, परिस्थितियों की संख्या में HPA गतिविधि पर नजर रखने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। घोड़ों के मल में ऊंचा corticosterone पोस्ट ऑपरेटिव पशु चिकित्सा उपचार 8 दौरान और प्रतिबंधात्मक आवास 9 में शामिल संभावित प्रतिकूल स्थितियों के जवाब में सूचना दी गई है। मल के नमूने एक जमा glucocorticoid बजाय इसे लंबे समय तक, क्रोनिक या मौसमी पैटर्न में 10 की निगरानी के लिए उपयुक्त बनाने के समय प्लाज्मा और लार द्वारा की पेशकश नमूने में बिंदु समय के साथ स्तर को दर्शाता है। गैर इनवेसिव के कारणविधि की प्रकृति, नमूने कब्जा या संयम 11 के लिए आवश्यकता के बिना एक व्यक्ति के लिए बार-बार एकत्र किया जा सकता है। हालांकि, विशिष्ट प्रजाति पेट पारगमन समय था जब एक नमूना प्रोटोकॉल की योजना बना ध्यान में रखा जाना चाहिए। घोड़ों में, पेट पारगमन समय के आसपास 18 घंटा 12 इसलिए, अधिवृक्क प्रतिक्रिया और बाद में corticosterone चयापचयों HPA अक्ष की प्रारंभिक सक्रियण के एक दिन बाद मल में पाया जा सकता है।
जब गैर-आक्रामक प्रतिरक्षा तकनीक का उपयोग प्रजातियों के लिए एक सावधान सत्यापन जांच की जा रही आवश्यक 13 है। इसके अलावा, हार्मोन मेटाबोलाइट उत्सर्जन में लिंग भेद चयापचय दर और corticosterone मेटाबोलाइट चूहों 14, और मुर्गियों 15 सहित विभिन्न प्रजातियों में उत्सर्जित के प्रकार में मतभेद के कारण शायद सूचित किया गया है। इसलिए यह इस पद्धति है कि परख दोनों पुरुष और महिला घरेलू घोड़ों में उपयोग के लिए मान्य किया गया था के हिस्से के रूप में महत्वपूर्ण था, क्योंकि वीं में विस्तृत हैई प्रोटोकॉल। लिंग के बीच हार्मोन चयापचय में यह अंतर यह शायद ही कभी किया जाता है को संबोधित किया और परख सत्यापन के हिस्से के रूप में शामिल अभी तक डेटा की गुणवत्ता के लिए परिणाम है।
यह गैर इनवेसिव विधि घरेलू घोड़ों में अधिवृक्क गतिविधि की लंबी अवधि के मूल्यांकन की अनुमति देता। प्रोटोकॉल विवरण दोनों परख के सत्यापन और परख तकनीक ही।
Protocol
Representative Results
Discussion
मलीय corticosterone विश्लेषण घोड़ों में अधिवृक्क गतिविधि की लंबी अवधि के पैटर्न का आकलन करने का एक साधन प्रदान करता है। विधि के गैर इनवेसिव प्रकृति लार और प्लाज्मा विश्लेषण 9 सहित अधिवृक्क गतिविधि का आकलन ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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