استراتيجية للتحقق من دور بوساطة Callose Plasmodesmal المحاصرة في الاستجابة مدار
Summary
توضح هذه المقالة الطرق لفحص الجينات السيطرة على نفاذية plasmodesmal والتدرج بالتالي أوكسين خلال استجابة مدار. وهذا يشمل قياس درجة استجابة استوائية في التحتفلقي من thaliana نبات الأرابيدوبسيس وفحص النفاذية plasmodesmal بواسطة حامض 8 hydroxypyrene-1،3،6-trisulfonic (HPTS) التحميل وتقييم مستوى callose أخيرا.
Abstract
وأوكسين هرمون النبات يلعب دورا هاما في كثير من عمليات النمو والتنموية، بما في ذلك ردود استوائية للضوء والجاذبية. إنشاء التدرج أوكسين هو الحدث الرئيسي مما أدى إلى توجه ضوئي وانتحاء أرضي. سابقا، وقد أظهرت النقل أوكسين القطبي (PAT) لإنشاء التدرج أوكسين في المجالات الخلوية المختلفة من النباتات. ومع ذلك، هان آخرون في الآونة الأخيرة أظهرت أن لتشكيل أوكسين التدرج السليم، plasmodesmal بوساطة callose الاتصال symplasmic بين الخلايا المجاورة هو أيضا عاملا حاسما. في هذه المخطوطة، واستراتيجية لإلقاء الضوء على دور جينات معينة، والتي يمكن أن تؤثر على توجه ضوئي وانتحاء أرضي عن طريق تغيير الربط symplasmic من خلال تحوير تركيب callose plasmodesmal، ومناقشتها. الخطوة الأولى هي لفحص ردود مدار الشاذة من الشتلات etiolated عمرها 3 أيام من المسوخ أو خطوط الإفراط في التعبير عن الجينات جنبا إلى جنب مع نوع البرية. هذا الفرز الأولييمكن أن يؤدي إلى تحديد مجموعة من الجينات تعمل في PAT أو السيطرة على الربط symplasmic. ويشمل الفحص الثاني في فرز المرشحين التي تظهر استجابات استوائية المتغيرة التي تؤثر على الربط symplasmic. للتصدي لهؤلاء المرشحين، تم فحص حركة التتبع symplasmic وترسب callose plasmodesmal. ان هذه الاستراتيجية أن تكون مفيدة لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي يمكن أن تنظم الربط symplasmic مباشرة أو بشكل غير مباشر من خلال ردود استوائية والعمليات التنموية الأخرى.
Introduction
النباتات، والكائنات الحية لاطئة، وضعت شبكة متطورة للغاية من الإشارات من خلية إلى خلية لمعالجة المحفزات البيئية المختلفة. ردود استوائية هي واحدة من الظواهر التي النباتات تستجيب للمؤثرات البيئية. تظهر النباتات ردين مدار الرئيسية، توجه ضوئي وانتحاء أرضي. النباتات الضوئي تنحني باتجاه مصدر الضوء التي توجه ضوئي لحصاد الطاقة القصوى. وبالمثل، انتحاء أرضي يجعل النباتات تنمو في اتجاه مركز الجاذبية. الآلية الأساسية التي تؤدي إلى مثل هذه الردود استوائية تتضمن تشكيل التدرج غير المتماثلة من هرمون نباتي أوكسين 1. فعل تشكيل أوكسين التدرج المحلي يتميز أيضا؛ الجينات التي تشارك في هذه الآلية توفر خارطة طريق لعمل هرمون 2-8. موقف محدد من الناقلات أوكسين هروب رأس المال، مثل تشكيل PIN (PIN) و ف بروتينات سكرية، ينفذ حركة أوكسين من السيتوبلازم إلى جدار الخلية من الخلايا المانحة 9،10. Furthermore، من قبل H + / IAA النشاط symport نشط من حاملات تدفق أوكسين، مثل AUX1 / البروتينات الأسرة التراخي، يتم تسليم أوكسين في النهاية إلى خلايا استقبال المجاورة 2،11،12. وتعرف هذه الحركة الاتجاه من أوكسين وسائل النقل أوكسين القطبي (PAT). بات يؤدي إلى توزيع التفاضلية أوكسين خلال مراحل النمو المختلفة، واستجابة لمختلف المحفزات البيئية 13،14. وعلاوة على ذلك، واضطراب في توطين أو التعبير عن أي من هذه الناقلات تدفق أو هروب رأس المال أوكسين يؤدي إلى تغيير حاد في PAT، الذي يؤدي إلى اختلال التدرج أوكسين، مما يؤدي إلى عيوب التنموية. في الآونة الأخيرة، وهان وآخرون. وذكرت أن تنظيم plasmodesmal ضروري أيضا للحفاظ على التدرج أوكسين 15. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 30 البروتينات plasmodesmal 16. ومن بين هذه البروتينات، تم الإبلاغ عن AtGSL8 كما إنزيم أساسي لتخليق callose في رابطات هيولية (PD)، وبالتالي تلعب دورا حيويا في صيانة العامةaining الحد PD حجم الاستبعاد (SEL). وأدى قمع التعبير AtGSL8 في نمط أوكسين التدرج مشوهة مما يؤدي إلى أي رد مدار على النقيض من الشتلات نوع البرية 15.
في هذه المخطوطة، وأساليب لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي تشارك في تنظيم PD يتم توفيرها. وقد استخدم AtGSL8 كما بروتين نموذج لاختبار هذه الطرق، كما هو الأنزيم الرئيسي المساهمة في PD الحيوي callose. ويرجع ذلك إلى الشتلات الفتك من المسوخ gsl8 خروج المغلوب 17، واستخدمت ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) -inducible خطوط رني وفقا لتقرير نشر في وقت سابق 15. الاستراتيجية المقدمة هنا يمكن تكييفها لفحص الجينات المسئولة ردا التحتفلقي مدار تسيطر عليها PD SEL.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، ووضع استراتيجية للكشف خطوط متحولة / الإفراط في التعبير التي هي معيبة في الردود موجه ضوئيا وgravitropic بسبب callose PD تغييرها، وبالتالي يوصف PD SEL في التفاصيل. ويتم إنجاز PD التوليف callose وتدهور بشكل رئيسي من قبل synthases callose وβ-1،3-Glucanases، ولكن يتم التحكم تنظيم هذه ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني، 2015R1A2A1A10053576)، ومنحة من برنامج الجيل التالي من BioGreen 21 (SSAC، منح PJ01137901)، إدارة التنمية الريفية، وجمهورية كوريا. ودعمت RK، WS، ABB وDK من الدماغ كوريا 21 زائد برنامج (BK21 +).
Materials
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
References
- Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. Phytohormones. Experimental biology monographs. , 204 (1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
- Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
- Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
- Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
- Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
- Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
- Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
- Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
- Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
- Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
- Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
- Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).
