एक साथ दो-फोटान<em> Vivo</em> माउस Retrosplenial कोर्टेक्स में अन्तर्ग्रथनी आदानों की इमेजिंग और postsynaptic लक्ष्य
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
दो photon माइक्रोस्कोपी रह रहे हैं और जानवरों के व्यवहार कर में मस्तिष्क की गतिविधियों के अवलोकन में क्रांति ला दी। 1990 में अपनी शुरुआत के बाद से इसे जल्दी से लोकप्रियता हासिल की और अब विवो 1,2 में मस्तिष्क की गतिविधियों के कई पहलुओं की परीक्षा की दिशा में सबसे दिलचस्प और अभिनव तरीकों में से एक के रूप में कार्यान्वित किया जाता है। इन आवेदनों और neuronal कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (कैल्शियम स्तर संकेतक या तत्काल जल्दी जीन अभिव्यक्ति का उपयोग, उदाहरण के लिए) रक्त प्रवाह माप, न्यूरोनल सक्रियण शामिल हैं। प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ रही दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, इन विवो ब्रेन इमेजिंग के लिए एक नए मानक के रूप में दुनिया भर में वैज्ञानिक तकनीक को लागू करने।
मानक दृष्टिकोण कपाल खिड़की का आरोपण बैरल या माउस मस्तिष्क 3 के दृश्य प्रांतस्था पर (कपाल एक गिलास को कवर के साथ कवर में एक गोल छेद) शामिल है। अगले, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, समझौता ज्ञापनएसई दृश्य और व्यवहार प्रशिक्षण सत्र की एक श्रृंखला आए, समय 4.5 ओवर मस्तिष्क की गतिविधियों और neuronal आकृति विज्ञान में परिवर्तन की निगरानी करने की इजाजत दी। दोनों ही मामलों में craniotomy केवल टांके पार करने के बिना, पार्श्विका हड्डी प्रभावित करता है। यह काफी हद तक माना जाता है कि तकनीक के मुख्य दोष ऐसे बैरल या दृश्य कोर्टेक्स के रूप में आसानी से सुलभ cortexes करने के लिए अपने सीमित आवेदन पत्र है। अन्य क्षेत्रों पर कपाल खिड़की का आरोपण अत्यधिक रक्तस्राव और / या स्थानिक बाधा के कारण काफी परेशानियों का बना हुआ है।
इस पत्र में हम retrosplenial कोर्टेक्स (आरएससी) विवो माइक्रोस्कोपी 6 में दो photon के लिए ब्याज की एक अन्य संभावित क्षेत्र के रूप में ऊपर कपाल खिड़की का आरोपण का प्रस्ताव। आरएससी मस्तिष्क सर्किट स्थानिक स्मृति गठन के लिए जिम्मेदार का एक महत्वपूर्ण तत्व है। Anatomically, आरएससी cortical, हिप्पोकैम्पस, और thalamic क्षेत्रों 7 जोड़ने के लिए एक न्यूरोनल नेटवर्क का एक हिस्सा है। यह हैभारी ऐसे स्थानिक सीखने और विलुप्त होने के साथ ही स्थानिक नेविगेशन 6 के रूप में व्यवहार, की एक श्रेणी में शामिल किया गया।
आदेश में न्यूरॉन्स की रूपात्मक परिवर्तन कल्पना करने के लिए हम एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) Thy1 प्रमोटर के तहत व्यक्त उपयोग करें। इन चूहों में, GFP दो photon माइक्रोस्कोपी 8 का उपयोग दिमाग में न्यूरॉन्स cortical axons और dendrites के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देने का लगभग 10% में व्यक्त किया जाता है। एक और नवीनता है कि हम प्रस्ताव एक पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 2/1 (rAAV2 / 1) आरएससी के लिए पेश मस्तिष्क के गहरे ढांचे में एक न्यूरॉन विशिष्ट CaMKII प्रमोटर 9 के तहत एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mCherry) कोडिंग के इंजेक्शन है हिप्पोकैम्पस के रूप में इस तरह के। Thy1-GFP माउस के हिप्पोकैम्पस में rAAV2 / 1 mCherry की अभिव्यक्ति hippocampo-cortica के पूर्व और postsynaptic तत्वों के एक साथ दृश्य के लिए अनुमति देता हैएल synapses 10। प्रोटीन axonal टर्मिनलों में पर्याप्त स्तर तक पहुँचने के लिए mCherry के rAAV संचालित अभिव्यक्ति दो से तीन सप्ताह की आवश्यकता है। इस अवधि में सामान्य समय craniotomy से वसूली के लिए आवश्यक के साथ संगत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान पत्र में हम एक कपाल खिड़की के माध्यम से अन्तर्ग्रथनी आदानों और आरएससी में पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों की vivo इमेजिंग में एक साथ दो photon के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। आरोपण की प्रक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों फिल्माने के साथ सहायता के लिए आवाज रिकॉर्डिंग, चित्र के लिए एम Borczyk, वायरस उत्पादन के लिए ए Trąbczyńska, जीनोटाइपिंग के लिए एम Ziókowska और ए Mirgos के लिए एम Steczkowski को धन्यवाद देना चाहूंगा। केआर पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस (rAAV) लालकृष्ण Deisseroth से CaMK प्रमोटर के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry व्यक्त की तरह का उपहार स्वीकार करता है। इस परियोजना के पशु मॉडल और ऊतक संरचना और समारोह, तंत्रिका जीव विज्ञान, प्रायोगिक जीवविज्ञान के Nencki संस्थान के केंद्र की प्रयोगशाला की प्रयोगशाला के मूल सुविधाओं पर बाहर किया गया था, यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषण घूमने के अलावा बुनियादी सुविधाओं के उपयोग के साथ – भीतर यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि आपरेशनल कार्यक्रम "अभिनव अर्थव्यवस्था" 2007-2013 के लिए। यह काम राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: सोनाटा बीआईएस 2012/05 / ई / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / एम / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / डब्ल्यू / NZ24 / 00,691 के.आर. और सोनाटा बीआईएस 2014 / 14 / ई / NZ4 / 00172 आर सी के लिए
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
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