ADN électroporation, isolement et d'imagerie de myofibres
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Myofibres individuels sont de grandes cellules syncytial, très organisée. Il ya quelques modèles de culture de cellules pour les muscles; Cependant, ces modèles ont comme limitation majeure qu'ils ne différencient pas complètement dans les fibres musculaires matures. Par exemple, les lignées de cellules C2C12 et L6 sont dérivées de souris et les rats, respectivement 4.1. Dans des conditions de famine de sérum, les cellules mononucléaires "de myoblastes comme« cesser la prolifération, subissent le retrait du cycle cellulaire, et entrent dans le programme myogénique former des cellules multinucléées avec sarcomères, appelées myotubes. Avec des conditions de culture prolongées, myotubes peuvent présenter des propriétés contractiles et "contraction" dans la culture. Lignées cellulaires humaines ont désormais été mis en place 5. En plus de ces lignées cellulaires immortalisées, myoblastes mononucléées peuvent être isolées de muscle et dans les conditions d'inanition de sérum semblables formera myotubes. Ces lignées cellulaires et des cultures primaires de myoblastes sont hautement utiliserful car elles peuvent être transfectées avec des plasmides ou des virus et transduites utilisés pour étudier des processus biologiques cellulaires de base. Cependant, ces cellules, même lorsque induite pour former des myotubes, manquent beaucoup des traits saillants de l'organisation musculaire mature. Plus précisément, les myotubes sont beaucoup plus petits que les fibres musculaires matures individuelles et manquent de la forme normale de fibres musculaires. Critique, myotubes manquent transversales (T-) tubules, le réseau membraneuse requis pour la libération de Ca efficace tout au long du myoplasme.
Une autre méthode pour myoblastes primaires ou lignées de cellules myogéniques consiste à utiliser myofibres matures. La transgénèse peut être utilisé pour établir l'expression de protéines marquées, mais cette méthode est coûteuse et prend du temps. In vivo électroporation de muscle de souris a émergé comme une méthode préférée pour sa vitesse et la fiabilité 6-10.
Méthodes pour électroporation in vivo et l'isolement efficace des myofibres haavez été optimisé pour le fléchisseur de la souris des orteils (FDB) 6 musculaire. Les procédés peuvent être effectués facilement et sont minimalement invasive pour induire l'expression in vivo à partir de plasmides. Cette approche est maintenant combinée à des méthodes d'imagerie à haute résolution, y compris l'imagerie après rupture de laser de la 6,7 sarcolemme. La combinaison de colorants fluorescents et de l'expression des protéines marquées par fluorescence de peut être utilisé pour surveiller des processus biologiques cellulaires en myofibres matures.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'utilisation d'électroporation pour étudier les protéines marquées par fluorescence in vivo est idéalement adapté pour l'étude du muscle étant donné l'absence de modèles de lignée cellulaire appropriée qui reproduisent fidèlement la structure de la cellule musculaire entière. Ce protocole décrit l'utilisation de l'électroporation et la microscopie confocale à haute résolution pour fournir une image détaillée de la localisation de la protéine et la translocation apr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé accorde NS047726, NS072027 et AR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
