Summary

A غليوبلاستوما الإنسان أورغانوتيبيك نموذج شريحة شريحة لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والآثار الخاصة بالمريض من الأدوية المضادة للغزو

Published: July 20, 2017
doi:

Summary

نماذج الجسم الحي السابقين الحالية من أرومة دبقية (غم) ليست الأمثل للدراسة ذات الصلة فسيولوجيا من غزو الورم البشري. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد وصيانة الثقافات شريحة عضوي النمط من الأنسجة غم الإنسان العذبة. وتقدم وصفا للمجهر الفاصل الزمني والهجرة الكمي تقنيات تحليل الهجرة.

Abstract

ورم أرومي غليوبلاستوما (غم) لا يزال يحمل التشخيص السريري للغاية سيئة على الرغم من العلاج الجراحي، العلاج الكيميائي، والعلاج الإشعاعي. غزو ​​الورم التقدمي في حمة الدماغ المحيطة يمثل تحديا علاجيا دائم. لتطوير العلاجات المضادة للهجرة ل غم، نظم نموذج التي توفر خلفية ذات صلة فسيولوجيا للتجربة المراقبة ضرورية. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الثقافات شريحة من الأنسجة غم الإنسان التي تم الحصول عليها خلال استئصال الجراحي. هذه الثقافات تسمح للتجريب خارج الجسم الحي دون المرور من خلال زينوغرافتس الحيوان أو خلية واحدة الثقافات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف استخدام الوقت الفاصل بين الليزر المسح الضوئي متحد البؤر المجهري بالتزامن مع تتبع الخلية لدراسة كمية السلوك المهاجرة للخلايا السرطانية والاستجابة المرتبطة بها للعلاجات. يتم إنتاجها بشكل متكرر شرائح في غضون 90 دقيقة من اكتساب الأنسجة الجراحية. الخلايا الوريدية الفلورسنت بوساطة ريتروفيراليبيلينغ، والتصوير مبائر، والتحليل الهجرة الورم الخلية في وقت لاحق في غضون أسبوعين من الثقافة. لقد استخدمنا بنجاح هذه الثقافات شريحة للكشف عن العوامل الوراثية المرتبطة بزيادة السلوك المهاجرة في غم البشري. علاوة على ذلك، لقد تحققنا من قدرة النموذج على الكشف عن الاختلاف الخاص بالمريض في الاستجابة للعلاجات المضادة للهجرة. المضي قدما، والثقافات شريحة غم الإنسان هي منصة جذابة لتقييم السريع السابقين الجسم الحي من حساسية الورم إلى العوامل العلاجية، من أجل دفع شخصية العلاج العصبية الأورام.

Introduction

دراسة المختبر من أرومة دبقية (غم)، يعوقها عدم وجود النماذج التي تلخص بأمانة الخصائص المرضية المطلوبة من المرض البشري، وهي هجرة الخلايا السرطانية والغزو. وقد كشفت الدراسات المقارنة من 2D و 3D في المقايسات الغزو في المختبر ، فضلا عن نماذج 3D شريحة القوارض ثقافة ميكانيكيا متباينة برامج الهجرة الخلوية في هذين السياقين، مما يحتمل أن تحد من ترانزلاتاباتيليتي النتائج من النظم 2D لمرض الإنسان 1 ، 2 ، 3 . الثقافة الورم النمط العضوي شريحة ونموذج التصوير الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية السرطانية داخل شرائح من الجسم الحي السابقين الأنسجة الورم البشري التي تم الحصول عليها من استئصال الجراحي. وهكذا، شريحة الثقافات من الأنسجة الورم مقطوع جراحيا بالتزامن مع المجهر متحد البؤر الوقت توفر منصة لدراسة الهجرة الخلايا السرطانية في الأمالمكروية دون انحلال الأنسجة أو ثقافة الممرات.

هناك الأدب واسعة تستخدم القوارض الدماغ نماذج شريحة شريحة من غم ولدت من زينوغرافتس الورم البشري، والأورام التي يسببها فيروسات، وتراكب الخلوية لدراسة غزو الورم 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . في الآونة الأخيرة، وقد وصفت عدة مجموعات الجيل من الثقافات شريحة عضوي النمط مباشرة من الأنسجة غم الإنسان 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 . ومع ذلك، هناك تباين ملحوظ بين البروتوكولات المنشورة فيما يتعلق تقنية التقطيع والثقافة وسائل الإعلام. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الثقافات شريحة عضوي النمط ركزت على نقاط النهاية التجريبية الثابتة التي شملت تغييرات في سيغنالي الخليةنانوغرام، انتشار، والموت. بروتوكول الموصوفة هنا توسع على نماذج الثقافة شريحة السابقة من خلال دمج الوقت حلها من السلوكيات الخلية السرطانية الديناميكية من خلال مرور الوقت الفاصل بين الليزر المسح الضوئي متحد البؤر المجهري. الاكتشاف الأخير من 11 و إنتراتومورال 12 ، 13 الاختلاف الجيني في غم الإنسان يؤكد على أهمية ربط هذا التغاير مع سلوك الخلايا السرطانية وآثارها على الاستجابة الورم للعلاج. هنا، ونحن تقرير بروتوكول مبسط وقابلة للتكرار لاستخدام الثقافات شريحة مباشرة من أنسجة سرطان الإنسان لتصور هجرة الخلايا السرطانية في القريب في الوقت الحقيقي.

Protocol

قبل البدء في جمع عينات أنسجة المرضى، يجب الحصول على الموافقة المستنيرة من كل مريض بموجب بروتوكول معتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (إيرب). تلقى مؤلفو هذا البروتوكول موافقة على العمل الموصوف بموجب بروتوكولات إيرب المعتمدة في مستشفى جامعة كولورادو ومستشفى إينوفا فيرفا?…

Representative Results

مجموعتنا قد ولدت بنجاح الثقافات شريحة من أكثر من 50 مريضا تمر استئصال غم الأولي. وقد تم تبسيط هذا الجيل شريحة، والثقافة، وروتوفيرال وضع العلامات، والتصوير، وبروتوكول تحليل الهجرة في سير العمل استنساخه ( الشكل 1 ). الأهم من ذلك، هذه شرائح غ…

Discussion

توفر الثقافات شريحة عضوي النمط من الأنسجة سرطان الإنسان منصة جذابة وغير مستغلة للتجريب ما قبل السريرية متعدية. فهم السلوكيات على مستوى السكان من الخلايا السرطانية فيما يتعلق بالهجرة، والانتشار، والموت الخلية في المكروية الورم الأصلي غير موجودة. من الأهمية بمكان، د…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر الدكتور لي نيسواندر والدكتور رادا مساروا على خبرتهم الفنية والمساهمات في بروتوكول شريحة بروتوكول التصوير مبائر وصفها هنا. مزيد من الشكر للدكتور كالين ديون الذي قدم الخبرة فيما يتعلق بتحسين معلمات تشريح الأنسجة الورم في الدماغ وثقافتها.

Materials

DMEM High Glucose  Invitrogen (Gibco) 11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red Invitrogen (Gibco) 12349-015
B-27 Supplement (50X), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15140-122
GlutaMAX Supplement Invitrogen (Gibco) 35050-061
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
HEPES (1 M) Invitrogen (Gibco) 15630-080
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638-20ML 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen (Gibco) 16520-050 Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher (Molecular Probes) I32450 Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector Clonetech 632520
Retro-X Concentrator  Clonetech 31455 Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector Clonetech 631530 part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells Clonetech 631530 part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) Sigma-Aldrich Z105899 Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) Polysciences, Inc. 18646A-1 Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas Fisher Scientific S50823 Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher Scientific  08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) Fisher Scientific 17-989-001 Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome Leica Biosystems VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert  EMD Millipore PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes  MatTek P35G-1.5-20-C Sleeve 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5
LSM 510 Confocal Micoscope Zeiss LSM 510 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator PeCON Germany (Discontinued) Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.

References

  1. Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
  2. Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
  3. Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
  4. Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
  5. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
  6. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
  7. Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
  8. Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
  9. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
  10. Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
  11. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
  12. Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
  13. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
  14. Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
  15. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
  16. Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
  17. Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
  18. Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
  19. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  20. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
  21. Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
  22. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
  23. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
  24. Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
  25. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
check_url/fr/53557?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. J. Vis. Exp. (125), e53557, doi:10.3791/53557 (2017).

View Video