نماذج الجسم الحي السابقين الحالية من أرومة دبقية (غم) ليست الأمثل للدراسة ذات الصلة فسيولوجيا من غزو الورم البشري. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد وصيانة الثقافات شريحة عضوي النمط من الأنسجة غم الإنسان العذبة. وتقدم وصفا للمجهر الفاصل الزمني والهجرة الكمي تقنيات تحليل الهجرة.
ورم أرومي غليوبلاستوما (غم) لا يزال يحمل التشخيص السريري للغاية سيئة على الرغم من العلاج الجراحي، العلاج الكيميائي، والعلاج الإشعاعي. غزو الورم التقدمي في حمة الدماغ المحيطة يمثل تحديا علاجيا دائم. لتطوير العلاجات المضادة للهجرة ل غم، نظم نموذج التي توفر خلفية ذات صلة فسيولوجيا للتجربة المراقبة ضرورية. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الثقافات شريحة من الأنسجة غم الإنسان التي تم الحصول عليها خلال استئصال الجراحي. هذه الثقافات تسمح للتجريب خارج الجسم الحي دون المرور من خلال زينوغرافتس الحيوان أو خلية واحدة الثقافات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف استخدام الوقت الفاصل بين الليزر المسح الضوئي متحد البؤر المجهري بالتزامن مع تتبع الخلية لدراسة كمية السلوك المهاجرة للخلايا السرطانية والاستجابة المرتبطة بها للعلاجات. يتم إنتاجها بشكل متكرر شرائح في غضون 90 دقيقة من اكتساب الأنسجة الجراحية. الخلايا الوريدية الفلورسنت بوساطة ريتروفيراليبيلينغ، والتصوير مبائر، والتحليل الهجرة الورم الخلية في وقت لاحق في غضون أسبوعين من الثقافة. لقد استخدمنا بنجاح هذه الثقافات شريحة للكشف عن العوامل الوراثية المرتبطة بزيادة السلوك المهاجرة في غم البشري. علاوة على ذلك، لقد تحققنا من قدرة النموذج على الكشف عن الاختلاف الخاص بالمريض في الاستجابة للعلاجات المضادة للهجرة. المضي قدما، والثقافات شريحة غم الإنسان هي منصة جذابة لتقييم السريع السابقين الجسم الحي من حساسية الورم إلى العوامل العلاجية، من أجل دفع شخصية العلاج العصبية الأورام.
دراسة المختبر من أرومة دبقية (غم)، يعوقها عدم وجود النماذج التي تلخص بأمانة الخصائص المرضية المطلوبة من المرض البشري، وهي هجرة الخلايا السرطانية والغزو. وقد كشفت الدراسات المقارنة من 2D و 3D في المقايسات الغزو في المختبر ، فضلا عن نماذج 3D شريحة القوارض ثقافة ميكانيكيا متباينة برامج الهجرة الخلوية في هذين السياقين، مما يحتمل أن تحد من ترانزلاتاباتيليتي النتائج من النظم 2D لمرض الإنسان 1 ، 2 ، 3 . الثقافة الورم النمط العضوي شريحة ونموذج التصوير الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية السرطانية داخل شرائح من الجسم الحي السابقين الأنسجة الورم البشري التي تم الحصول عليها من استئصال الجراحي. وهكذا، شريحة الثقافات من الأنسجة الورم مقطوع جراحيا بالتزامن مع المجهر متحد البؤر الوقت توفر منصة لدراسة الهجرة الخلايا السرطانية في الأمالمكروية دون انحلال الأنسجة أو ثقافة الممرات.
هناك الأدب واسعة تستخدم القوارض الدماغ نماذج شريحة شريحة من غم ولدت من زينوغرافتس الورم البشري، والأورام التي يسببها فيروسات، وتراكب الخلوية لدراسة غزو الورم 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . في الآونة الأخيرة، وقد وصفت عدة مجموعات الجيل من الثقافات شريحة عضوي النمط مباشرة من الأنسجة غم الإنسان 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 . ومع ذلك، هناك تباين ملحوظ بين البروتوكولات المنشورة فيما يتعلق تقنية التقطيع والثقافة وسائل الإعلام. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الثقافات شريحة عضوي النمط ركزت على نقاط النهاية التجريبية الثابتة التي شملت تغييرات في سيغنالي الخليةنانوغرام، انتشار، والموت. بروتوكول الموصوفة هنا توسع على نماذج الثقافة شريحة السابقة من خلال دمج الوقت حلها من السلوكيات الخلية السرطانية الديناميكية من خلال مرور الوقت الفاصل بين الليزر المسح الضوئي متحد البؤر المجهري. الاكتشاف الأخير من 11 و إنتراتومورال 12 ، 13 الاختلاف الجيني في غم الإنسان يؤكد على أهمية ربط هذا التغاير مع سلوك الخلايا السرطانية وآثارها على الاستجابة الورم للعلاج. هنا، ونحن تقرير بروتوكول مبسط وقابلة للتكرار لاستخدام الثقافات شريحة مباشرة من أنسجة سرطان الإنسان لتصور هجرة الخلايا السرطانية في القريب في الوقت الحقيقي.
توفر الثقافات شريحة عضوي النمط من الأنسجة سرطان الإنسان منصة جذابة وغير مستغلة للتجريب ما قبل السريرية متعدية. فهم السلوكيات على مستوى السكان من الخلايا السرطانية فيما يتعلق بالهجرة، والانتشار، والموت الخلية في المكروية الورم الأصلي غير موجودة. من الأهمية بمكان، د…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر الدكتور لي نيسواندر والدكتور رادا مساروا على خبرتهم الفنية والمساهمات في بروتوكول شريحة بروتوكول التصوير مبائر وصفها هنا. مزيد من الشكر للدكتور كالين ديون الذي قدم الخبرة فيما يتعلق بتحسين معلمات تشريح الأنسجة الورم في الدماغ وثقافتها.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |