Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.
Glioblastom (GBM) weiterhin eine extrem schlechte klinische Prognose trotz chirurgischen, chemotherapeutischen und Strahlentherapie zu tragen. Progressive Tumorinvasion in das umliegende Hirnparenchym stellt eine dauerhafte therapeutische Herausforderung dar. Um Anti-Migrationstherapien für GBM zu entwickeln, sind Modellsysteme, die einen physiologisch relevanten Hintergrund für kontrolliertes Experimentieren bieten, unerlässlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung von Scheibenkulturen aus humanem GBM-Gewebe, das während der chirurgischen Resektion gewonnen wird. Diese Kulturen erlauben Ex-vivo- Experimente ohne Passage durch tierische Xenotransplantate oder Einzelzellkulturen. Weiterhin beschreiben wir die Verwendung von zeitraffer Laserscanning-konfokalen Mikroskopie in Verbindung mit der Zellverfolgung, um das Migrationsverhalten von Tumorzellen quantitativ zu untersuchen und die Resonanz auf Therapeutika zu beurteilen. Scheiben werden innerhalb von 90 min der chirurgischen Gewebeerfassung reproduzierbar erzeugt. Retrovirally-vermittelte fluoreszierende Zelle laBeling, konfokale Bildgebung und Tumorzellmigrationsanalysen werden anschließend innerhalb von zwei Wochen der Kultur abgeschlossen. Wir haben diese Scheibenkulturen erfolgreich eingesetzt, um genetische Faktoren aufzudecken, die mit einem erhöhten Migrationsverhalten im menschlichen GBM verbunden sind. Weiterhin haben wir die Fähigkeit des Modells validiert, eine patientenspezifische Variation in Reaktion auf Anti-Migrationstherapien zu detektieren. Nach vorne gehen menschliche GBM-Slice-Kulturen eine attraktive Plattform für eine schnelle Ex-vivo- Beurteilung der Tumorsensitivität gegenüber therapeutischen Wirkstoffen, um eine personalisierte neuro-onkologische Therapie voranzutreiben.
Die Laborstudie des Glioblastoms (GBM) wird durch einen Mangel an Modellen behindert, die die notwendigen pathologischen Eigenschaften der menschlichen Erkrankung, nämlich die Tumorzellmigration und die Invasion, treu rezitieren. Vergleichende Untersuchungen von 2D- und 3D- In-vitro- Invasions-Assays sowie 3D-Nagetier-Slice-Kulturmodellen haben in diesen beiden Kontexten mechanistisch disparate zelluläre Migrationsprogramme aufgedeckt, die möglicherweise die Übersetzbarkeit von Befunden von 2D-Systemen auf die menschliche Erkrankung 1 , 2 , 3 beschränken . Das hier beschriebene organotypische Tumorscheiben-Kultur- und Bildgebungsparadigma ermöglicht die Untersuchung der Tumorzellmigration innerhalb von ex vivo menschlichem Tumorgewebe, erhalten aus chirurgischer Resektion. So bieten Scheibenkulturen von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe in Verbindung mit zeitraffer konfokaler Mikroskopie eine Plattform, um die Tumorzellmigration im Eingeborenen zu untersuchenMikroumgebung ohne Gewebeauflösung oder Kulturpassage.
Es gibt umfangreiche Literatur, die Nagetier-Hirn-Slice-Kulturmodelle von GBM aus menschlichen Tumor-Xenotransplantaten, retroviral-induzierten Tumoren und zellulären Overlays zur Untersuchung der Tumorinvasion 1 , 2 , 3 , 4 , 5 verwendet . Kürzlich haben mehrere Gruppen die Erzeugung von organotypischen Scheibenkulturen direkt aus dem menschlichen GBM-Gewebe 6 , 7 , 8 , 9 , 10 beschrieben . Allerdings gibt es eine deutliche Variation zwischen veröffentlichten Protokollen in Bezug auf Schneidtechnik und Kulturmedien. Weiterhin konzentrierte sich die Verwendung von organotypischen Scheibenkulturen auf statische experimentelle Endpunkte, die Änderungen der Zellsignale beinhaltenNg, Proliferation und Tod. Das hier beschriebene Protokoll dehnt sich auf vorherige Scheibenkulturparadigmen aus, indem die zeitaufgelöste Beobachtung von dynamischen Tumorzellverhalten durch zeitkonstante Laserscanning-konfokale Mikroskopie aufgenommen wird. Die jüngste Entdeckung von inter 11 und intratumoraler 12 , 13 genetischer Variation in humanem GBM unterstreicht die Bedeutung der Verknüpfung dieser Heterogenität mit Tumorzellverhalten und deren Auswirkungen auf die Reaktion des Tumors auf die Therapie. Hier berichten wir über ein stromlinienförmiges und reproduzierbares Protokoll für die Verwendung von direkten Scheibenkulturen aus einem menschlichen Krebsgewebe, um die Tumorzellmigration in nahezu Echtzeit zu visualisieren.
Organotypische Scheibenkulturen aus menschlichem Krebsgewebe bieten eine attraktive und nicht genutzte Plattform für präklinische Translationsversuche. Das Verständnis von Populationsniveaus von Tumorzellen in Bezug auf Migration, Proliferation und Zelltod in der nativen Tumormikroumgebung fehlt. Kritisch kann das Studium der Tumorreaktion auf die Therapie in einer dynamischen, zeitaufgelösten Weise auf der Ebene des Zellverhaltens Licht auf neue Mechanismen der Behandlungsresistenz werfen. Menschliche Tumorscheiben…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Lee Niswander und Dr. Rada Massarwa für ihre technische Expertise und Beiträge zu dem hier beschriebenen Slice Culture Confocal Imaging Protokoll. Weiterhin dank Dr. Kalen Dionne, der Fachwissen zur Optimierung von Hirntumor-Gewebe-Schneid- und Kulturparametern lieferte.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |