ट्यूमर सेल प्रवासन और रोगी-विशिष्ट एंटी-इनवेसिव ड्रग्स के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक मानव ग्लोबब्लास्टोमा ऑरोगोटेपिक स्लाइस कल्चर मॉडल
Summary
ग्लूब्लास्टोमा (जीबीएम) के वर्तमान पूर्व विवो मॉडल मानवीय ट्यूमर आक्रमण के शारीरिक अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यहां, हम नए मानव जीबीएम टिशू से अंगोटीपिक स्लाइस संस्कृतियों के निर्माण और रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। समय-चूक माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक सेल प्रवासन विश्लेषण तकनीकों का वर्णन प्रदान किया गया है।
Abstract
सर्जरी, रसायन चिकित्सा, और विकिरण चिकित्सा के बावजूद ग्लिब्ब्लास्टोमा (जीबीएम) एक बेहद खराब नैदानिक रोग का निदान जारी रखता है। आसपास के मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रगतिशील ट्यूमर आक्रमण एक स्थायी चिकित्सीय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। जीबीएम के लिए स्थलांतरण चिकित्सा विकसित करने के लिए, मॉडल सिस्टम जो नियंत्रित प्रयोग के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक पृष्ठभूमि प्रदान करते हैं, आवश्यक हैं। यहां, हम सर्जिकल रेशों के दौरान प्राप्त जीनबीएम ऊतक से टुकड़ा संस्कृतियों को पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इन संस्कृतियों पशु एक्सनोग्रेट्स या एकल सेल संस्कृतियों के माध्यम से बिना उत्तरार्द्ध के पूर्व विवो प्रयोग के लिए अनुमति देते हैं इसके अलावा, हम समय-चूक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी सेल ट्रैकिंग के साथ संयोजन में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार की मात्रात्मक व्यवहार का अध्ययन और चिकित्सीय विज्ञान के लिए संबंधित प्रतिक्रिया का वर्णन करते हैं। शल्य चिकित्सा के ऊतक अधिग्रहण के 90 मिनट के भीतर स्लाइस प्रतिजन उत्पन्न होते हैं। रेट्रोवायरली-मध्यस्थता वाले फ्लोरोसेंट सेल लाबेलिंग, कन्फोकल इमेजिंग, और ट्यूमर सेल माइग्रेशन विश्लेषण को दो सप्ताह की संस्कृति के भीतर पूरा किया जाता है। मानव जीबीएम में बढ़ते प्रवासी व्यवहार से संबंधित आनुवंशिक कारकों को उजागर करने के लिए हमने इन स्लाइस संस्कृतियों का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। इसके अलावा, हमने एंटी-माइग्रेशन थेरेपिज़ के जवाब में रोगी-विशिष्ट भिन्नता का पता लगाने के लिए मॉडल की क्षमता को मान्य किया है। आगे बढ़ते हुए, मानव जीबीएम टुकड़ा संस्कृतियां, चिकित्सकीय एजेंटों के लिए ट्यूमर की संवेदनशीलता के तेज पूर्व विवो मूल्यांकन के लिए एक आकर्षक मंच हैं, ताकि व्यक्तिगत न्यूरो-ऑनकोल्जिक थेरेपी अग्रिम कर सकें।
Introduction
ग्लोबोब्लास्टोमा (जीबीएम) का प्रयोगशाला अध्ययन, ऐसे मॉडल की कमी से बाधित है, जो मानवीय रोगों की आवश्यक पाथोलोगिक विशेषताओं को ईमानदारी से दोहराता है, अर्थात् ट्यूमर सेल प्रवासन और आक्रमण। इन 2 संदर्भों में 2 डी और 3 डी के इन विट्रो आक्रमण आक्रमणों के साथ तुलनात्मक अध्ययनों के साथ-साथ 3 डी कृंतक टुकड़ा संस्कृति मॉडल ने यंत्रवत् रूप से भिन्न सेलुलर प्रवास कार्यक्रमों का खुलासा किया है, जो संभावित रूप से 2 डी सिस्टम से मानव रोग 1 , 2 , 3 के निष्कर्षों की अनुवाद क्षमता सीमित कर रहे हैं। यहां वर्णित अंगोटीपिक ट्यूमर स्लाइस कल्चर और इमेजिंग प्रतिमान से सर्जरी के लसीकरण से प्राप्त पूर्व विवो मानव ट्यूमर के टिशू के स्लाइस में ट्यूमर सेल प्रवासन के अध्ययन के लिए अनुमति मिलती है। इस प्रकार, समय-समाप्त confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में शल्य चिकित्सा resected ट्यूमर के ऊतक के टुकड़े संस्कृतियों देशी में ट्यूमर सेल प्रवासन का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदानऊतक विघटन या संस्कृति उत्कर्ष के बिना microenvironment
ट्यूमर आक्रमण 1 , 2 , 3 , 4 , 5 का अध्ययन करने के लिए मानव ट्यूमर एक्सनोग्राफ्ट, रेट्रोवायरल प्रेरित ट्यूमर, और सेलुलर ओवरले से उत्पन्न जीबीएम के कृंतक मस्तिष्क स्लाइस कल्चर मॉडलों का व्यापक प्रकाशन है। हाल ही में, कई समूहों ने मानव जीबीएम ऊतक 6 , 7 , 8 , 9 , 10 से सीधे ऑर्गोटीपिक स्लाइस संस्कृतियों की पीढ़ी का वर्णन किया है। हालांकि, स्लाइसिंग तकनीक और संस्कृति मीडिया के संबंध में प्रकाशित प्रोटोकॉल के बीच चिह्नित भिन्नताएं हैं। इसके अलावा, अंगोटीपिक स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग ने स्थैतिक प्रयोगात्मक समापन बिंदुओं पर केंद्रित किया है जिसमें सेल सिग्नल में परिवर्तन शामिल हैंएनजी, प्रसार, और मृत्यु यहां वर्णित प्रोटोकॉल समय-विलंब लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से गतिशील ट्यूमर सेल व्यवहार के समय-सुलझा प्रेक्षण को शामिल करके पूर्व स्लाइस संस्कृति मानदंडों पर फैलता है। आंतरिक 11 की खोज और इंट्राममोरल 12 , मानव जीबीएम में 13 आनुवांशिक विविधता ट्यूमर सेल व्यवहार के साथ इस विविधता को जोड़ने और चिकित्सा के ट्यूमर प्रतिक्रिया पर इसके निहितार्थ को महत्व देते हैं। यहां, हम एक वास्तविक कैसटर टिश्यू से सीधी स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग के लिए एक सुव्यवस्थित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं ताकि निकट वास्तविक समय में ट्यूमर सेल माइग्रेशन की कल्पना कर सकें।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव कैंसर के ऊतकों से ऑर्गोटेपिक स्लाइस संस्कृतियों पूर्व-नैदानिक अनुवादिक प्रयोग के लिए एक आकर्षक और अंडूइलाइज्ड प्लेटफॉर्म प्रदान करती है। देशी ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट में माइग्रेशन, प्रसार ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए डॉ ली ली निस्वांडर और डा। रदा मस्वार्वा को धन्यवाद देना चाहते हैं, जो यहाँ वर्णित टुकड़ा संस्कृति की कन्फोकल इमेजिंग प्रोटोकॉल में योगदान है। मस्तिष्क ट्यूमर के ऊतक टुकड़ों के टुकड़ों और संस्कृति के मानकों को अनुकूलित करने के बारे में विशेषज्ञता प्रदान करने वाले डॉ। कलन डायनेन के अतिरिक्त धन्यवाद
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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