Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos
Summary
Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.
Abstract
El glioblastoma (GBM) sigue teniendo un pronóstico clínico extremadamente pobre a pesar de la terapia quirúrgica, quimioterapéutica y de radiación. La invasión tumoral progresiva en el parénquima cerebral circundante representa un desafío terapéutico duradero. Para desarrollar terapias anti-migración para GBM, los sistemas modelo que proporcionan un fondo fisiológicamente relevante para la experimentación controlada son esenciales. Aquí, presentamos un protocolo para generar cultivos de corte de tejido GBM humano obtenido durante la resección quirúrgica. Estos cultivos permiten la experimentación ex vivo sin pasar a través de xenoinjertos animales o cultivos de células individuales. Además, se describe el uso de lapso de tiempo láser exploración microscopía confocal en relación con el seguimiento de células para estudiar cuantitativamente el comportamiento migratorio de las células tumorales y la respuesta asociada a la terapéutica. Las rebanadas se generan de forma reproducible dentro de los 90 minutos de la adquisición de tejido quirúrgico. Célula fluorescente mediada por retrovirusBeling, imágenes confocales y análisis de migración de células tumorales se completan posteriormente dentro de las dos semanas de cultivo. Hemos utilizado con éxito estos cultivos de sectores para descubrir los factores genéticos asociados con el aumento del comportamiento migratorio en el GBM humano. Además, hemos validado la capacidad del modelo para detectar variación específica del paciente en respuesta a terapias anti-migración. Avanzando, los cultivos de trozos GBM humanos son una plataforma atractiva para la evaluación rápida ex vivo de la sensibilidad tumoral a agentes terapéuticos, con el fin de avanzar en la terapia neuro-oncológica personalizada.
Introduction
El estudio de laboratorio del glioblastoma (GBM), se ve obstaculizado por la falta de modelos que recapitulan fielmente las características patológicas requeridas de la enfermedad humana, a saber, la migración e invasión de células tumorales. Los estudios comparativos de los ensayos de invasión in vitro 2D y 3D, así como los modelos de cultivo de roedores triturados en 3D, han descubierto programas de migración celular dispares de forma mecánica en estos dos contextos, limitando potencialmente la traslación de los hallazgos de los sistemas 2D a la enfermedad humana 1 , 2 , 3 . El cultivo de corte de tumor organotípico y el paradigma de formación de imágenes descrito aquí permite el estudio de la migración de células tumorales dentro de cortes de tejido tumoral humano ex vivo obtenido de resección quirúrgica. Por lo tanto, los cultivos en rebanadas de tejido tumoral resecado quirúrgicamente junto con la microscopía confocal de lapso de tiempo proporcionan una plataforma para estudiar la migración de células tumorales en la región nativaMicroambiente sin disolución de tejido o pasaje de cultivo.
Existe una extensa literatura empleando modelos de cultivo de GBM generados a partir de xenoinjertos tumorales humanos, tumores inducidos por retrovirus y superposiciones celulares para estudiar la invasión tumoral 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Recientemente, varios grupos han descrito la generación de cultivos de corte organotípico directamente de tejido GBM humano 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Sin embargo, existe una marcada variación entre los protocolos publicados con respecto a la técnica de corte y los medios de cultivo. Además, el uso de cultivos de corte organotípico se ha centrado en puntos finales experimentales estáticos que han incluido cambios en la señal celularNg, proliferación y muerte. El protocolo descrito aquí se expande sobre paradigmas previos de cultivo de rebanadas mediante la incorporación de observación resuelta en tiempo de comportamientos dinámicos de células tumorales a través de la microscopía confocal de barrido por láser de lapso de tiempo. El descubrimiento reciente de la variación genética inter 11 e intratumoral 12 , 13 en GBM humano subraya la importancia de vincular esta heterogeneidad con comportamientos de células tumorales y sus implicaciones en la respuesta tumoral a la terapia. Aquí, informamos de un protocolo racionalizado y reproducible para el uso de cultivos de rebanada directa de un tejido de cáncer humano para visualizar la migración de células tumorales en casi tiempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cultivos de cortes organotípicos procedentes de tejidos de cáncer humano proporcionan una plataforma atractiva y subutilizada para la experimentación de traducción preclínica. Falta conocimiento de los comportamientos poblacionales de las células tumorales con respecto a la migración, la proliferación y la muerte celular en el microambiente tumoral nativo. De manera crítica, el estudio de la respuesta tumoral a la terapia de una manera dinámica y resuelta en el tiempo a nivel del comportamiento celular pue…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Lee Niswander y al Dr. Rada Massarwa por su experiencia técnica y sus contribuciones al protocolo de imagen confocal de cultura de corte descrito aquí. Además, gracias al Dr. Kalen Dionne, que aportó su experiencia en la optimización del corte del tejido tumoral cerebral y los parámetros de cultivo.
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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