Nuvarande ex vivo- modeller av glioblastom (GBM) är inte optimerade för fysiologiskt relevant studie av humant tumörinvasion. Här presenterar vi ett protokoll för generering och underhåll av organotypa skivkulturer från frisk human GBM-vävnad. En beskrivning av time-lapse-mikroskopi och kvantitativ cellmigrationsanalyssteknik tillhandahålls.
Glioblastom (GBM) fortsätter att bära en extremt dålig klinisk prognos trots kirurgisk, kemoterapeutisk och strålbehandling. Progressiv tumörinvasion i omgivande hjärnparenchyma representerar en bestående terapeutisk utmaning. För att utveckla anti-migrerande terapier för GBM är väsentliga systemsystem som ger en fysiologiskt relevant bakgrund för kontrollerat experiment. Här presenterar vi ett protokoll för att generera skivkulturer från human GBM-vävnad erhållen under kirurgisk resektion. Dessa kulturer möjliggör experiment ex vivo utan passage genom djur xenotransplantat eller enskilda cellkulturer. Vidare beskriver vi användningen av time-lapse laserscanning-konfokalmikroskopi i samband med cellspårning för att kvantitativt studera tumörcellernas migrerande beteende och associerat svar på terapeutiken. Skivor genereras reproducerbart inom 90 minuter av kirurgiskt vävnadsförvärv. Retroviralt medierad fluorescerande cell laBeling, konfokal imaging och tumörcell migreringsanalyser avslutas därefter inom två veckor av odling. Vi har framgångsrikt använt dessa skivkulturer för att avslöja genetiska faktorer som hör samman med ökat migrerande beteende i human GBM. Vidare har vi validerat modellens förmåga att upptäcka patientspecifik variation som svar på anti-migrerande terapier. Förflyttning framåt är humana GBM-skivkulturer en attraktiv plattform för snabb ex vivo- bedömning av tumörkänslighet för terapeutiska medel, för att främja personlig neuro-onkologisk terapi.
Laboratorieundersökningen av glioblastom (GBM) hindras av brist på modeller som troget rekapitulerar de nödvändiga patologiska egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen, nämligen tumörcells migration och invasion. Jämförande studier av 2D- och 3D- in vitro- analyser samt 3D-gnagarekulturmodeller har upptäckt mekaniskt olika cellmigreringsprogram i dessa två sammanhang, vilket potentiellt begränsar översättbarheten hos fynd från 2D-system till den mänskliga sjukdomen 1 , 2 , 3 . Det organotypa tumörskivningskulturen och avbildningsparadigmet som beskrivs här möjliggör studier av tumörcells migrering inom skivor av human vätskevävnad ex vivo erhållen från kirurgisk resektion. Sålunda tillhandahåller skivkulturer av kirurgiskt återvunnen tumörvävnad i samband med tidsförlust-konfokalmikroskopi en plattform för att studera tumörcells migrering i det inföddaMikromiljö utan vävnadsupplösning eller kulturpassage.
Det finns omfattande litteratur med användning av gnagare hjärnskivans odlingsmodeller av GBM genererad från humant tumör xenografter, retrovirala inducerade tumörer och cellulära överlagringar för att studera tumörinvasion 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Nyligen har flera grupper beskrivit genereringen av organotypa skivkulturer direkt från human GBM-vävnad 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Det finns emellertid en märkbar variation bland publicerade protokoll med avseende på skivteknik och kulturmedia. Vidare har användningen av organotypa skivkulturer fokuserat på statiska experimentella ändpunkter som har inkluderat förändringar i cell signalerNg, proliferation och död. Protokollet som beskrivs häri expanderar på tidigare skivodlingsparadigmer genom införlivande av tidsupplöst observation av dynamiska tumörcellsbeteenden genom tidsförlängning av laserskanning av konfokal mikroskopi. Nyligen upptäckt av inter 11 och intratumoral 12 , 13 genetisk variation i human GBM understryker betydelsen av att länka denna heterogenitet med tumörcellsbeteenden och dess konsekvenser för tumörrespons på terapi. Här rapporterar vi ett strömlinjeformat och reproducerbart protokoll för användning av direktskärkulturer från en mänsklig cancervävnad för att visualisera migrering av tumörceller i nära realtid.
Organotypa skivkulturer från mänsklig cancervävnad ger en attraktiv och underutnyttjad plattform för prekliniska translationella experiment. Förståelse av befolkningsnivåbeteenden hos tumörceller med avseende på migration, proliferation och celldöd i den naturliga tumörmiljömiljön saknas. Kritiskt kan studier av tumörrespons på terapi på ett dynamiskt, tidsbeslutat sätt vid cellnivåbeteendet avslöja nya mekanismer för behandlingsresistens. Humana tumörskivkulturer tillhandahåller en länk mellan de…
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka Dr Lee Niswander och Dr. Rada Massarwa för deras tekniska expertis och bidrag till protokollet om slice culture confocal imaging som beskrivs här. Vidare tack till Dr Kalen Dionne som tillhandahöll kompetens för att optimera hjärntumörsskivning och kulturparametrar.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |