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Article de méthode

Désacétylation essais pour démêler les Interplay entre sirtuines (SIRT2) et protéines substrats spécifiques

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DOI :

10.3791/53563

⸱

27 février 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory for Molecular Cancer Biology, Department of Radiation Oncology, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Radiation Oncology, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les étapes requises pour exécuter des tests de désacétylation in vitro et in vivo afin d’établir le rôle des protéines en tant que substrats de désacétylation spécifiques pour les sirtuines et d’étudier plus en détail le rôle de l’acétylation réversible de la lysine en tant que modification post-traductionnelle.

Résumé

L’acétylation est apparue comme une modification post-traductionnelle importante (PTM) régulant une pléthore de processus et de fonctions cellulaires. Ceci est également soutenu par des découvertes récentes en protéomique basée sur la spectrométrie de masse à haute résolution montrant que de nombreuses nouvelles protéines et sites au sein de ces protéines peuvent être acétylés. Cependant, l’identité des enzymes régulant ces protéines et ces sites est souvent inconnue. Parmi ces enzymes, les sirtuines, qui appartiennent à la classe III des histones lysine désacétylases, ont suscité un grand intérêt en tant qu’enzymes régulant l’acétylome dans différentes conditions physiologiques ou physiopathologiques. Nous décrivons ici des méthodes pour lier SIRT2, la sirtuine cytoplasmique, à ses substrats, y compris des tests de désacétylation in vitro et in vivo. Ces tests peuvent être appliqués dans des études axées sur d’autres membres de la famille des sirtuines pour démêler le rôle spécifique des sirtuines et sont nécessaires afin d’établir l’interaction réglementaire de certaines désacétylases avec leurs substrats comme première étape pour mieux comprendre le rôle de l’acétylation des protéines. De plus, de tels tests peuvent être utilisés pour distinguer les sites d’acétylation fonctionnels sur une protéine de ce qui peut être des lysines acétylées non régulatrices, ainsi que pour examiner l’interaction entre une désacétylase et son substrat dans un contexte physiologique.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles (PTM) régulent les réseaux de signalisation cellulaire, permettant aux cellules de répondre rapidement aux signaux internes et externes. Au cours des dernières décennies, de nombreux PTM différents jouant un rôle central dans divers processus ont été identifiés, mais seuls quelques-uns ont été étudiés de manière approfondie, tels que la phosphorylation, l’acétylation et l’ubiquitination 1-3. En se concentrant sur l’acétylation, Allfrey et al. ont été les premiers à proposer un rôle pour l’acétylation des histones dans la régulation de la transcription des gènes il y a environ 50 ans 4. Des recherches dans ce domaine ont révélé que l’acétylation de l’histone lysine module la condensation de la chromatine et qu’elle est considérée comme une marque épigénétique faisant partie du code d’histone 5. Bien qu’il ait fallu beaucoup de temps avant la découverte de la tubuline comme première cible d’acétylation non histones 6, il est maintenant bien établi que des centaines de protéines eucaryotes au-delà des histones peuvent être acétylées et que l’acétylation de la lysine a été reconnue comme une PTM largement répandue qui peut rivaliser avec la phosphorylation et l’ubiquitination dans sa prévalence 7-9. Il est intéressant de noter que les protéines acétylées non histones peuvent être des molécules de signalisation dans le cytoplasme, des facteurs de transcription dans le noyau et des enzymes métaboliques dans les mitochondries, soulignant l’importance de l’acétylation dans la régulation d’une pléthore de processus cellulaires.

L’état d’acétylation d’une protéine dépend de la fonction coordonnée et opposée des lysine acétyltransférases (KAT) et des lysine désacétylases (KDACs) qui ajoutent et éliminent des groupes acétyle des protéines. L’acétylation réversible de la lysine, qui implique la neutralisation d’une charge positive 10, modifie la structure de la protéine et il semble très probable qu’elle altère également la fonction enzymatique dans plusieurs cas 11-13. En se concentrant sur les KDACs, 18 protéines ont été identifiées dans les génomes humains et de souris 14-16. Parmi eux, les sirtuines de mammifères (également appelées histones lysine désacétylases de classe III), qui se distinguent des autres membres par le fait qu’elles nécessitent du NAD+ pour leur fonction enzymatique, ont suscité un vif intérêt dans ce domaine de recherche 16. Chez les mammifères, sept sirtuines (SIRT1-7) ont été identifiées, chacune d’entre elles partageant un domaine central catalytique conservé de 275 acides aminés, qui sont principalement classés en fonction de leur localisation subcellulaire dans le noyau (SIRT1, 6 et 7), les mitochondries (SIRT3, 4 et 5) ou le cytoplasme (SIRT2). SIRT1-3 a une activité de désacétylation robuste, tandis que SIRT4 présente une activité ADP-ribosyltransférase, SIRT5 peut fonctionner comme une protéine désuccinylase et démalonylase, et SIRT6 et SIRT7 présentent une faible activité désacétylase mais sont impliqués dans d’autres types d’acylations 17. Conformément à l’importance de l’acétylation en tant que modification régulatrice de la PTM impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires, les sirtuines ont également été impliquées dans un large éventail de processus. Après les premières études révolutionnaires établissant le rôle des sirtuines dans l’allongement de la durée de vie, il a été démontré qu’elles sont impliquées dans diverses fonctions cellulaires, notamment la réparation de l’ADN, le maintien de l’instabilité génomique, l’apoptose, la réponse au stress et à l’inflammation, le contrôle de l’efficacité énergétique, des horloges circadiennes et du métabolisme, ainsi que la contribution à l’initiation et/ou à la progression de maladies liées à l’âge telles que le cancer. neurodégénérescence et diabète de type 2 15,16.

Malgré les progrès significatifs dans le domaine de la biologie des sirtuines, il reste encore du travail à faire pour démêler les rôles et fonctions non découverts grâce à l’identification de nouveaux substrats. Les progrès récents de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MS) à haute résolution ont considérablement augmenté le nombre de protéines acétylées, mais surtout ont identifié plusieurs lysines acétylées différentes dans chaque protéine, affirmant que l’acétylation peut être aussi répandue que d’autres PTM telles que la phosphorylation 7,8,17. Compte tenu du fait que des désacétylases spécifiques n’ont pas encore été identifiées pour la plupart de ces protéines-substrats acétylés, il est raisonnable de suggérer que des essais de désacétylation in vitro et in vivo sont nécessaires pour confirmer et établir une protéine acétylée comme substrat légitime d’une désacétylase spécifique. Dans les protocoles expérimentaux décrits ci-dessous, des détails seront donnés sur la façon d’effectuer des essais de désacétylation in vitro et in vivo en utilisant SIRT2 comme désacétylase spécifique.

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Protocole

1. Essai in vitro désacétylation

  1. Purification de SIRT2
    1. Préparer une boîte de cellules HEK 293T cultivées dans 8 ml de DMEM avec 10% de FBS et des antibiotiques et cultivées dans un 37 ° C, 5% CO 2 culture tissulaire incubateur à environ 70% de confluence le jour suivant culture de 10 cm.
    2. Le lendemain, co-transfecter 4 pg pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector faite dans notre laboratoire), 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (emballage vecteur) et 0,5 pg de pCMV-VSV-G (vecteur d'enveloppe) 18 en utilisant la polyéthylèneimine (PEI) à un rapport de 3 ul d' ADN / pg de PEI.
    3. Changer les médias après 12 h.
    4. Recueillir surnageant après 36-48 h.
    5. Retirer les débris par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
    6. Après filtration de 0,22 um filtres, faire 1 ml aliquotes de SIRT2 lentivirus et de garder à -80 ° C.
    7. SIRT2 lentivirus décongélation sur de la glace (il est important de stocker le virus à -80 ° C lorsque le virus n'a pas été utilisé).
    8. Infecter une plaque à 6 puits de 80 à 90% des cellules 293T confluentes HEK avec 1 ml d'un lentivirus, en présence de 8 pg / ml de polybrène.
    9. Placez les cellules infectées par le virus dans 37 ° C incubateur jusqu'au lendemain (24 h).
    10. Remplacer milieu après 24 h.
    11. 48 heures après l'infection, vérifier l'efficacité de l'infection par la détection de cellules positives à la GFP au microscope à fluorescence.
    12. Si l' efficacité de l' infection est bonne (au moins 40 à 50% des cellules infectées), remplacer milieu par du milieu de culture contenant 2 pg / ml de puromycine pour sélectionner des SIRT2 stables sur des cellules exprimant.
      Remarque: Cette opération prend environ 2 semaines, et le milieu est changé tous les 3-4 jours. Les cellules non infectées meurent au cours de cette période de sélection, et seules les cellules infectées par le lentivirus SIRT2 croître.
    13. Analyser l'expression de SIRT2 étiquetée Flag par transfert de Western en utilisant un anticorps anti-Flag (1: 1000 dilution) après l'exécution de 40 pg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE à 10% avant de commencer la purifprocessus de ication (recommandé) 19,20.
    14. Pour purifier SIRT2 actif, des cellules intermédiaires en rapport 1: 3 par trypsinisation afin d'avoir suffisamment de boîtes de cellules HEK 293T stable surexprimant Flag-SIRT2 (Dix boîtes de 10 cm permettront la purification de suffisamment de protéines pour des expériences ultérieures).
      1. Pour trypsiniser les cellules, éliminer le milieu de culture et d'éliminer le sérum résiduel par rinçage des cellules avec du DPBS stériles. Ajouter lentement 2,5 ml d'une solution de trypsine-EDTA à 0,25% pour couvrir la monocouche cellulaire, incuber à température ambiante pendant 30 à 45 secondes. Après avoir enlevé la solution de trypsine-EDTA, on incube à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Puis ajouter le milieu de culture et de transférer les cellules à de nouveaux plats.
    15. Retirer le milieu de culture, laver les cellules deux fois dans du PBS et recueillir les cellules par trypsinisation suivies par centrifugation à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    16. Lyse culot cellulaire dans 500 pi de tampon de lyse A (20 mM HEPES , pH 7,9, 18 mM de KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM de MgCl2, 20% de glycerol, 0,1% de NP-40) comprenant un cocktail d'inhibiteurs de la protéase et de 1 uM de TSA pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    17. Centrifuger à 14 000 xg pendant 15 min à 4 ° C et on transfert le surnageant dans un nouveau tube.
    18. Effectuer une immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose comme décrit ci-dessous.
      1. Ajouter 200 à 300 pi d'anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose au lysat des protéines (10 à 20 mg de protéines totales).
      2. Incuber une nuit à 4 ° C sous agitation constante.
      3. Recueillir immunoprécipités par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      4. Laver le culot 5 fois avec 10 ml de tampon de lyse A à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C. Après chaque lavage, les billes sédimenter et remplacer le surnageant avec le tampon A.
    19. Préparer la solution Drapeau de peptide 1x (y compris un cocktail d'inhibiteurs de la protéase et 1 uM TSA dans du PBS).
    20. Ajouter 500 pi de 1x Drapeau peptidsolution e aux billes d'agarose et incuber pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    21. Recueillir le surnageant par centrifugation à 6000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    22. Répétez deux étapes précédentes.
    23. Retirer les perles à partir du surnageant en utilisant des tubes de filtration et une centrifugation à 15 000 x g pendant 1 min à 4 ° C.
    24. Concentrer l'échantillon élué jusqu'à ce que la concentration finale en protéine est de 1 pg / pl en utilisant une membrane d'ultrafiltration.
    25. Vérifiez procédé de purification par électrophorèse effectuant en utilisant 1 pg de l'échantillon élue.
    26. Gel tache avec une solution de coloration disponible dans le commerce pour confirmer la purification de SIRT2.
    27. Gardez SIRT2 purifiée à -80 ° C.
  2. Purification de la protéine-substrat acétylé
    1. 10 cm x préparer des boîtes de culture de 10 cm avec des cellules HEK 293T à environ 70% de confluence le jour suivant.
    2. Les cellules lendemain, co-transfecter avec 5 ug d'un drapeau tagged vecteur plasmidique expressing la protéine de support, ainsi que 5 ug de l'acétyl-transférase spécifique qui peut acétyler la protéine en utilisant PEI à un rapport de 3 ul d'ADN / pg de PEI.
      Remarque: Si l'acétyl-transférase spécifique est pas connue, co-transfecter avec un mélange d'histones connu acétyl-transférases (HATS) tels que p300, CBP, GCN5, Tip60 et PCAF.
    3. Changer le milieu après 12 h.
    4. La veille de la lyse des cellules, de traiter les cellules avec 1 uM de TSA et 2 mM de nicotinamide (NAM) pendant une nuit en remplaçant le milieu de culture avec un milieu contenant du TSA / NAM afin de maximiser les niveaux de la protéine substrat d'acétylation en inhibant désacétylases.
    5. 48 heures après la transfection, éliminer le milieu de culture, le lavage des cellules deux fois dans du PBS et recueillir les cellules par trypsinisation suivie d'une centrifugation à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    6. Lyse culot cellulaire dans 500 pi de tampon de lyse par boîte A (20 mM HEPES, pH 7,9, 18 mM de KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM de MgCl2, 20% de glycerol, 0,1% de NP-40) comprenant une protéase inhibitors cocktail, 1 uM TSA et NAM 2 mM pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    7. Centrifuger à 14 000 xg pendant 15 min à 4 ° C et on transfert le surnageant dans un nouveau tube.
    8. Effectuer une immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose comme décrit ci-dessous.
      1. Ajouter 200 à 300 pi d'anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose au lysat des protéines (10 à 20 mg de protéines totales).
      2. Incuber une nuit à 4 ° C sous agitation constante.
      3. Recueillir immunoprécipités par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      4. Laver le culot 2 fois avec 10 ml de tampon de lyse A à 1000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après chaque lavage, les billes sédimenter et remplacer le surnageant avec un tampon de lyse A.
      5. Laver le culot 3 fois avec 10 ml de tampon de lyse A sans NAM à 1000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après chaque lavage, les billes sédimenter et remplacer le surnageant avec un tampon de lyse A. Il est important pas porter sur toute NAM à la réaction de désacétylation.
    9. Préparer la solution Drapeau de peptide 1x (y compris les inhibiteurs de la protéase et 1 uM TSA dans du PBS).
    10. Ajouter 500 ul de solution peptidique 1x drapeau aux billes d'agarose et on incube pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    11. Recueillir le surnageant par centrifugation à 6000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    12. Répétez deux étapes précédentes.
    13. Retirer les perles à partir du surnageant en utilisant des tubes de filtration et une centrifugation à 15 000 x g pendant 1 min à 4 ° C.
    14. En utilisant une membrane d'ultrafiltration, on concentre jusqu'à ce que l'échantillon élué la concentration en protéine est de 1 ug / ul.
    15. Effectuer l'électrophorèse en exécutant 1 pl de l'échantillon élue sur un gel SDS-PAGE 4-12%.
    16. Confirmer l'acétylation de la protéine substrat par transfert de Western en utilisant des anticorps dirigés contre l'Ac-K (1: 1000 dilution) et la protéine-substrat (dilution dépend de l'anticorps spécifique utilisé).
    17. Gardez purifiée acétyle protéine-substrat à -80 ° C.
  3. La désacétylation in vitro Réaction
    1. Préparer le tampon de désacétylation B (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM MgCl 2 0,5 pM de TSA)
    2. Préparer des 3 différentes réactions dans des tubes différents dans un volume final de 20 pi (tableau 1).
    3. Inclure des réactions supplémentaires pour confirmer la désacétylation de la protéine substrat par SIRT2 (facultatif). Ajouter 2 pg de désacétylation purifié nulle SIRT2 mutant (ce qui peut être fait en utilisant le protocole décrit en 1.1 après avoir utilisé un lentivirus pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) pour la réaction au lieu de désacétylase SIRT2 actif ou ajouter 10 mM de nicotinamide (NAM ) la réaction d'inhiber l'activité de désacétylation de SIRT2 (tableau 1).
    4. Incuber les réactions pendant 3 heures à 30 ° C sous agitation constante.
    5. Arrêter la réaction en ajoutant 20 pi de tampon d'échantillon 2x et faire bouillir les échantillons fou 10 min à 95 ° C.
    6. Effectuer une électrophorèse en exécutant le mélange réactionnel sur un gel SDS-PAGE à 4-12% et à détecter l'état d'acétylation de la protéine substrat par transfert de Western en utilisant un Ac-K anticorps anti (1: 1000 dilution) 19,20.

2. Essai in vivo désacétylation

  1. SIRT2 surexpression dans des cellules cultivées
    1. Préparer 10 plats cm de culture avec les cellules HEK 293T surexprimant de manière stable pCDH-puro-GFP-vecteur vide, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag et pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (tel que décrit dans 1.1) pour être environ 70 % confluentes.
    2. En variante, la préparation des boîtes de culture de 10 cm avec des cellules confluentes à environ 70% et d'effectuer une surexpression transitoire en utilisant 5 pg des vecteurs mentionnés ci-dessus en utilisant PEI à un rapport de 3 ul d'ADN / pg de PEI.
    3. Effectuer western blot d'extraits cellulaires totaux en utilisant un anticorps anti-Flag (1: 1000 dilution) pour démontrer la surexpression de Flag-tagged SIRT2 19.
  2. Interférence ARN à Knockdown SIRT2 dans des cellules cultivées
    1. Préparer un plat de cellules HEK 293T de culture de 10 cm à environ 70% de confluence le jour suivant.
    2. Le lendemain, co-transfecter 4 pg pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 pg pCMV dR8.2 dvpr (vecteur d'emballage) et 0,5 pg de pCMV-VSV-G (vecteur d'enveloppe) 18 en utilisant de la polyéthylèneimine (PEI) dans un rapport de 3 ul d'ADN / pg de PEI.
      Note: Pour abattre SIRT2, nous utilisons des shRNA en épingle à cheveux simples dans le vecteur pLKO.1 lentiviral conçu par Le RNAi Consortium (TRC).
    3. Suivez la procédure décrite au point 1.1 pour produire shSIRT2 lentivirus et infecter les cellules cibles à knockdown SIRT2.
    4. Effectuer un transfert de Western d'extraits cellulaires totaux en utilisant un anticorps anti-SIRT2 (1: 1000 dilution) pour démontrer l' efficacité SIRT2 effet de choc après l' exécution de 40 pg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE à 10%.
    5. Alternativement,préparer 10 plats de culture de cellules cm avec environ 70% de confluence et effectuer knockdown transitoire de SIRT2 utilisant siRNA suivant les instructions du fabricant.
    6. Effectuer un transfert de Western d'extraits cellulaires totaux en utilisant un anticorps anti-SIRT2 (1: 1000 dilution) pour démontrer l' efficacité SIRT2 effet de choc après l' exécution de 40 pg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE à 10%.
  3. Immunoprécipitation et immunotransfert pour détecter les niveaux acétylés dans les cellules cultivées
    1. 12 h avant de recueillir les culots cellulaires à partir soit des cellules surexprimant SIRT2 (voir 2.1 ci - dessus) ou SIRT2 renversé cellules (voir 2.2 ci - dessus), ajouter 1 pm TSA au milieu de culture pour inhiber la classe III désacétylases non histones.
    2. Retirer le milieu de culture, laver les cellules deux fois dans du PBS et recueillir les cellules par trypsinisation suivies par centrifugation à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Ajouter 10 ml de tampon de lyse A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM de KCl, mM EGTA 0,2, 1,5mM de MgCl2, 20% de glycerol, 0,1% de NP-40) comprenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase, 1 uM de TSA et 2 mM NAM.
    4. Incuber à 4 ° C pendant 30 min sous rotation constante.
    5. Collecter les surnageants par centrifugation à 20.000 xg pendant 15 minutes à 4 ° C.
    6. Calculer la concentration de protéines en utilisant un dosage de protéine de Bradford.
    7. Transfert 1 mg de protéine totale dans de nouveaux tubes dans un volume final de 1 ml en utilisant un tampon de lyse A. Utilisation Tableau 2 comme référence pour préparer des échantillons de protéines à partir de cellules surexprimant soit SIRT2 ou après SIRT2 effet de choc.
    8. Effectuer une immunoprécipitation en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine-substrat spécifique avec la protéine A / G (40 ul de suspension de billes est recommandée). Vous pouvez également utiliser un anticorps anti Ac-K conjugué à des billes d'agarose (20 pi perles suspension est généralement suffisant) pour immunoprécipiter toutes les protéines acétylés.
    9. Incuber les échantillons à 4 ° C sous constant rotation pendant une nuit.
    10. Recueillir immunoprécipités par centrifugation à 1000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    11. Lavez perles 5 fois avec 1 ml de tampon A à 1000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    12. Remettre les billes dans 40 pl de tampon 2x échantillon.
    13. échantillons Faire bouillir pendant 10 min à 95 ° C.
    14. Effectuer une électrophorèse en exécutant les échantillons élues (40 ul provenant de l'étape 02/03/12) sur un gel de SDS-PAGE à 4-12%, sans perturber les billes tout en transférant les échantillons élues.
    15. Détecter les niveaux acétylée de la protéine substrat par transfert de Western en utilisant un anticorps anti-Ac-K (1: 1000 dilution) dans le cas d'un anticorps spécifique de la protéine-substrat a été utilisé pour l'immunoprécipitation, ou un anticorps spécifique dirigé contre la protéine-substrat (suivi les recommandations l'anticorps spécifique en ce qui concerne la dilution) dans le cas des billes anti-Ac-K ont été utilisées pour immunoprécipitation.

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Résultats

Pour qu'une protéine doit être considérée comme une cible de désacétylation légitime pour toute enzyme ayant une activité de désacétylation, à la fois in vitro et in vivo , des essais de désacétylation doivent être effectués pour déterminer l'interaction entre la déacétylase et son substrat. Pour le dosage désacétylase in vitro, à la fois la purification de la déacétylase et le substrat de protéine acétylée est nécessaire avant que le dosage peut être e...

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Discussion

De récentes études protéomiques à haut débit ont établi que l’acétylation est une PTM répandue trouvée non seulement dans le noyau mais aussi dans le cytoplasme et les mitochondries 7,8,21-23. Compte tenu de la probabilité que beaucoup plus de protéines et de sites acétylés n’aient pas été détectés pour plusieurs raisons, telles que la spécificité des anticorps anti-Ac-K utilisés, la faible abondance des protéines acétylées et la nature transitoire de la PTM, il est prudent de prédire que d’autres protéines ac...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Le projet décrit ici a été soutenue par une subvention du NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), ainsi que par le Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - La Lefkofsky Family Foundation / Liz et Bourse de recherche Eric Lefkofsky Innovation à AV Nous aimerions à remercier les membres du laboratoire (Carol O'Callaghan et Elizabeth Anne Wayne) pour la lecture critique et l'édition de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
paraboles de culture cellulaireDenville Scientific Inc.T1110 et T1115
pCDH-puro-GFPSystem BiosciencesCD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (vecteur d’emballage)Addgene8455
pCMV-VSV-G (vecteur d’enveloppe)Addgene8454
polyéthylénimine (PEI)  ;Polysciences inc.24885D’autres réactifs de transfection peuvent également être utilisés. L’IPE est rentable et très efficace pour transfecter des cellules 293T
0,22 &mu ; m filtresDenville Scientific Inc.Microscope fluorescent F5512
polybrèneSigmaH9268
Carl Zeiss MicroImaging Inc.Axiovert 200
puromycineInvivogenA11138-03
PBSCorning21-031-CM
anticorps anti-drapeauSigmaF3165
HEPES  ;SigmaH3375
KClSigmaP9541
GlycérolSigmaG5516
NP-40Sigma74385
MgCl2SigmaM9272
EGTASigma34596
inhibiteurs de protéase coctail 100xBiotoolB14001
Trichostatine A (TSA)SigmaT8552inhibiteur sélectif des histones désacétylases (HDACs) de classe I et II mais pas des HDACs (sirtuines) de classe IIIbilles
d’agarose anti-FlagCentrifugeuse SigmaA2220
Eppendorf5417R
rotateurThermo Scientific415220Q
tubes filtrantsMilliporeUFC30HV00
Flag peptide  ;SigmaF3290
Vivaspin ConcentrateurSartorius Stedim Biotech S.A.VS0102
SimplyBlue SafeSolution de teintureInvitrogenLC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x)Life TechologiesNP0007
Tris-HCl pH 7.5SigmaT5941
NAD+SigmaN0632cofacteur requis pour les sirtuines
nicotinamide (NAM)Sigma72340inhibiteur sélectif de classe III HDACs (sirtuines)
pLKO.1 vecteur lentiviral  ;Addgene8453
SIRT2 si ARN  ;Anticorps
Proteintech15345-1-AP
Bradford dosage des protéinesBIO-RAD500-0006
billes d’agaroseImmunechemICP0388
Vecteur lentiviral centrifuge anti-SIRT2 Qiagen GS22933

Références

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
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