Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren
Summary
Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.
Abstract
Geburtsfehler, bei denen der Großhirnrinde – auch bekannt als Fehlbildungen der kortikalen Entwicklung (MCD) – sind wichtige Ursachen für geistige Behinderung und 20-40 % der pharmakoresistente Epilepsie im Kindesalter. Hochauflösenden bildgebenden hat in Vivo Identifizierung einer großen Gruppe von MCD Phänotypen erleichtert. Trotz der Fortschritte in der Bildgebung des Gehirns, genomische Analyse und Generierung von Tiermodellen fehlt ein einfache Workflow, systematisch Kandidatengene priorisieren und funktionelle Auswirkungen der vermeintlichen Mutationen testen. Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine experimentelle Strategie ermöglicht die Identifizierung von neuartigen verursachenden Gene für MCD entwickelt und validiert. Diese Strategie basiert auf identifizierende Kandidat genomische Regionen oder Gene über Array-CGH oder ganze Exome Sequenzierung und charakterisieren die Auswirkungen ihrer Inaktivierung oder der Überexpression des spezifischen Mutationen bei der Entwicklung von Nagetier Gehirne über in utero Elektroporation. Dieser Ansatz führte zur Identifikation des C6orf70 -Gens, Codierung für eine vermeintliche vesikuläre Protein zur Pathogenese der periventrikulären noduläre Heterotopie, ein MCD verursacht durch mangelhafte neuronale Migration.
Introduction
Die Hirnrinde spielt eine Schlüsselrolle in kognitiven und intellektuellen Prozesse und emotionale Kontrolle ebenso wie lernen und Gedächtnis beteiligt ist. Es ist daher nicht verwunderlich, dass viele neurologische und psychiatrische Erkrankungen von Fehlbildungen der kortikalen Entwicklung (MCD) führen. Die Ätiologie der MCD ist komplex, da beide erworben und genetische Faktoren beteiligt sind. Die kumulative Prävalenz der genetisch bedingten Anteil der MCD ist etwa 2 % und sie sind in den meisten Fällen sporadisch. Zum Beispiel die Inzidenz der angeborene Gehirn Dysgenesie höher als 1 % der menschlichen Bevölkerung geschätzt wurde, und einige Formen von MCD eingehalten werden, bei mehr als 14 % aller Patienten mit Epilepsie und in 40 % der schweren oder hartnäckigen Epilepsie1, 2.
Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist eines der am häufigsten verwendeten MCDs und wird durch abnorme Migration der Neuronen aus der ventrikulären Zone (VZ) der entwickelnden Hirnrinde verursacht. Das Scheitern der Neuronen, Ergebnisse in Clustern von heterotopisch Neuronen entlang der Wände der seitlichen Ventrikel zu migrieren, die in der Regel mit Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) visualisiert werden können. Die klinischen, anatomischen und bildgebende Merkmale der PNH sind heterogen. Knötchen reichen von kleinen und einseitige bilateralen und symmetrisch. Gemeinsame klinische Folgeerscheinungen enthalten Epilepsie und geistige Behinderung3. Mutationen im gen Filamin A (oder FLNA), die in Xq28 Landkarten, fanden sich in 100 % der Familien mit X-chromosomal bilaterale PNH und in 26 % der sporadischen Patienten3,4. Eine seltene, rezessive Form der PNH verursacht durch Mutationen im ARFGEF2 -gen, die in 20q13 Landkarten, wurde in zwei konsanguinen Familien5berichtet. Vor kurzem wurden biallelische Mutationen in Genen Codierung der Rezeptor-Ligand-Cadherin-paar DCHS1 und FAT4 in eine multisystemische Erkrankung, die PNH6umfasst neun Patienten identifiziert. PNH auch zugeordnete Fragiles-X Syndrom7, Williams-Syndrom8, 22q11 Mikrodeletion Syndrom9, Duplikationen bei 5 p 1510, Streichungen bei 1 p 3611, 5q14.3-F1512, 6 p 2513 und 6q terminal löschen-Syndrom14,15,16,17,18,19, was darauf hindeutet, dass zusätzliche verursachenden Gene verteilt sind während des Genoms. Jedoch bleibt für etwa 74 % der sporadischen PNH Patienten die genetische Grundlagen aufgeklärt17.
Klassische gen Zuordnung Ansätze wie Array Comparative genomische Hybridisierung (Array-CGH) haben sich bewährt, dass eine leistungsfähige Werkzeuge zur Erkennung von submikroskopischer Chromosomenanomalien, jedoch die genomischen Regionen identifiziert, die Verwendung dieses Ansatzes sind oft große und zahlreiche Gene enthalten.
Das Aufkommen der massiven parallelen Sequenzierung Techniken (d.h. ganze Exome Sequenzierung (WES) und gesamte Genom Sequenzierung (WGS)) hat die Kosten und den Zeitaufwand für eine gesamte menschliche Exome oder Genom-Sequenz deutlich reduziert. Interpretation von WES und WGS Daten bleibt jedoch herausfordernd in den meisten Fällen, da für jeden Patienten Dutzende bis Hunderte (oder sogar Tausende, abhängig von der Art der Analyse) Varianten von Filtern von Daten entstehen.
Um den Prozess der Identifizierung neuer MCD verursachenden Gene, einer neuartige systematischen Strategie verbindet Array-CGH zu beschleunigen, wurde WES und in Utero Elektroporation (IUE) Screening von Kandidatengenen entwickelt. IUE kann selektiv deaktivieren (oder overexpress) bestimmter Gene oder Mutationen in Nagetier Gehirne, schnelle Auswertung von ihrer Beteiligung an Kortikogenese18,19. RNAi vermittelte-Zuschlag oder Überexpression des einen oder mehrere Kandidaten-Gene wird voraussichtlich dazu führen, dass wenn das Gen Krankheitsentwicklung, lokalisierte Mängel in neuronalen Migration und/oder Reifung zugeordnet ist. Bei der Identifizierung eines Gens, dessen Inaktivierung (oder Überexpression) den Phänotyp bei Patienten in den Nagetieren beobachtet reproduziert, wird eine hervorragende Kandidatin für das Screening bei sporadischen Patienten mit MCD. Mit diesem Ansatz, ergeben wir vor kurzem den entscheidenden Beitrag des C6orf70 -Gens (auch bekannt als ERMARD) in der Pathogenese der PNH bei Patienten mit 6q27 chromosomalen Deletionen16.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCDs sind wichtige Ursachen für geistige Behinderung und für 20-40 % von Medikamenten-resistenten Kindheit Epilepsie1,2. Interesse an MCDs hat im letzten Jahrzehnt durch zwei wesentliche Faktoren drastisch zugenommen. Die erste ist die Verbesserung der bildgebenden (besonders MRI), wodurch Sie Ärzte und Wissenschaftler viele Hirnfehlbildungen zu visualisieren, die zuvor nicht erkannt wurden. Die andere ist die Entwicklung der genetischen Werkzeuge, die die Ide…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Dr. G. McGillivray, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, PR. d. h. Scheffer, Pr. S.P. Roberston, Pr. J. Clayton-Smith und PR s.f. Berkovic für die Bereitstellung von MCD-Patienten. Wir danken Dr. F. Michel und D. Mei für technische Beratung und Hilfe. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel aus dem sieben Rahmenprogramm der EU, Wunsch-Projekt, Vertragsnummer: Gesundheit-F2-602531-2013 (zu V.C, r.g., A.R, A.F. und c.c.), INSERM (zum A.R und c.c.), Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA, A.F, E.P.P und C.C) und Région Provence-Alpes-Côte d ‘ Azur (APO2014 – DEMOTISCHE, c.c. und A.A.D). D.A.K ist ein EMBO Young Investigator und wird unterstützt vom FWF gewährt (I914 und P24367).
Materials
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
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