एक उपंयास रणनीति सरणी के संयोजन-CGH, पूरे exome अनुक्रमण और कुतर में Utero Electroporation में मस्तिष्क विकृतियों के लिए करणीय जीन की पहचान करने के लिए में
Summary
Periventricular गांठदार heterotopia (PNH) वयस्कता में cortical development (MCD) की कुरूपता का सबसे सामान्य रूप है लेकिन इसका आनुवंशिक आधार सबसे अधिक छिटपुट मामलों में अज्ञात रहता है. हमने हाल ही में एमसीडी के लिए उपंयास उंमीदवार जीन की पहचान करने के लिए और सीधे vivo मेंअपने करणीय भूमिका की पुष्टि करने की रणनीति विकसित की है ।
Abstract
जंम दोष है कि मस्तिष्क प्रांतस्था-भी cortical विकास (एमसीडी) की विकृतियों के रूप में जाना शामिल-बौद्धिक विकलांगता और बचपन में दवा प्रतिरोधी मिर्गी के 20-40% के लिए खाते के महत्वपूर्ण कारण हैं । हाई-रिजोल्यूशन ब्रेन इमेजिंग ने वीवो में एमसीडी phenotypes के एक बड़े समूह की पहचान की सुविधा दी है । मस्तिष्क इमेजिंग में अग्रिम के बावजूद, जीनोमिक विश्लेषण और पशु मॉडलों की पीढ़ी, एक सीधा कार्यप्रवाह व्यवस्थित उंमीदवार जीन को प्राथमिकता देने के लिए और ख्यात उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक प्रभाव परीक्षण के लिए याद आ रही है । इस समस्या को दूर करने के लिए, एमसीडी के लिए उपंयास करणीय जीन की पहचान को सक्षम करने के लिए एक प्रयोगात्मक रणनीति विकसित और मान्य किया गया था । इस रणनीति के आधार पर उंमीदवार जीनोमिक क्षेत्रों या सरणी-CGH या पूरे exome अनुक्रमण के माध्यम से जीन की पहचान करने और उनके निष्क्रियता के प्रभाव या निस्र्पक के माध्यम से कुतर दिमाग विकसित करने में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के व्यक्त करने पर आधारित है utero electroporation । इस दृष्टिकोण C6orf70 जीन की पहचान के लिए नेतृत्व किया, एक ख्यात vesicular प्रोटीन के लिए एंकोडिंग, periventricular गांठदार heterotopia, एक एमसीडी दोषपूर्ण ंयूरॉंस प्रवास के कारण की रोगजनन के लिए ।
Introduction
सेरेब्रल प्रांतस्था संज्ञानात्मक और बौद्धिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और भावनात्मक नियंत्रण में शामिल है और साथ ही सीखने और स्मृति । इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई स्नायविक और मनोरोग रोगों cortical विकास (एमसीडी) की विकृतियों से परिणाम है । दोनों के अधिग्रहण और आनुवंशिक कारकों से जुड़े होने के बाद से एमसीडी का एटियलजि जटिल है । एमसीडी के आनुवंशिक रूप से निर्धारित अनुपात की संचई व्यापकता के बारे में 2% है और वे ज्यादातर मामलों में छिटपुट हैं । उदाहरण के लिए, जन्मजात मस्तिष्क dysgenesis की घटना मानव आबादी में 1% से अधिक होने का अनुमान था, और एमसीडी के कुछ रूपों में मिर्गी के साथ सभी रोगियों के 14% से अधिक में मनाया जाता है और गंभीर या असभ्य मिर्गी के ४०% में1, 2.
Periventricular गांठदार Heterotopia (PNH) सबसे आम एमसीडी में से एक है और न्यूरॉन्स के वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZ) से विकासशील सेरेब्रल प्रांतस्था के असामान्य प्रवास के कारण होता है. न्यूरॉन्स की विफलता पार्श्व निलय की दीवारों के साथ heterotopic न्यूरॉन्स के समूहों में परिणाम स्थानांतरित करने के लिए जो आम तौर पर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग कर visualized किया जा सकता है. PNH के नैदानिक, शारीरिक और इमेजिंग विशेषताएं विषम हैं । पिंड छोटे और एकतरफा द्विपक्षीय और सममित से सीमा हो सकती है । कॉमन क्लिनिकल sequelae में मिर्गी और बौद्धिक शक् ति3शामिल है । Filamin एक (या FLNA) जीन में उत्परिवर्तनों, जो Xq28 में नक्शे, एक्स के साथ परिवारों के १००% में पाया गया द्विपक्षीय PNH और छिटपुट रोगियों के 26% में3,4से जुड़े थे । PNH के एक दुर्लभ, अवकाश के रूप में ARFGEF2 जीन है, जो 20q13 में नक्शे में उत्परिवर्तनों की वजह से, दो आशावादी परिवारों में सूचित किया गया है5। हाल ही में, रिसेप्टर एंकोडिंग जीन में biallelic उत्परिवर्तनों-ligand cadherin जोड़ी DCHS1 और FAT4 नौ एक multisystemic विकार है कि PNH6शामिल से प्रभावित रोगियों में पहचान की गई है । PNH भी नाजुक एक्स सिंड्रोम के साथ जुड़ा हुआ है7, विलियंस सिंड्रोम8, 22q11 microdeletion सिंड्रोम9, 5p15 पर दोहराव10, 1p3611में विलोपन, 5q 14.3-q1512, 6p2513 और 6q टर्मिनल विलोपन सिंड्रोम14,15,16,17,18,19, सुझाव है कि अतिरिक्त करणीय जीन बिखरे हुए हैं जीनोम के दौरान । तथापि, लगभग ७४% छिटपुट PNH रोगियों के आनुवंशिक आधार के लिए17का आविर्भाव होना शेष रहता है.
इस तरह के सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सरणी-CGH) के रूप में शास्त्रीय जीन मानचित्रण दृष्टिकोण उप सूक्ष्म गुणसूत्र विषमताओं का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित किया है, तथापि, जीनोमिक क्षेत्रों की पहचान इस दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे है अक्सर बड़े और कई जीन होते हैं ।
बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण तकनीक के आगमन (यानी पूरे-Exome अनुक्रमण (वेस) और पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS)) काफी लागत और एक पूरे मानव Exome या जीनोम अनुक्रम करने के लिए आवश्यक समय कम हो गया है । फिर भी, वेस और WGS डेटा की व्याख्या मामलों के बहुमत में चुनौतीपूर्ण रहता है, के बाद से सैकड़ों के लिए प्रत्येक रोगी दसियों के लिए (या भी हजारों, विश्लेषण के प्रकार के आधार पर) वेरिएंट डेटा फ़िल्टरिंग से उभरने ।
उपंयास एमसीडी करणीय जीन की पहचान की प्रक्रिया को गति देने के लिए, एक उपंयास व्यवस्थित सरणी-CGH, वेस और utero electroporation (IUE) उंमीदवार जीन की स्क्रीनिंग के संयोजन की रणनीति डिजाइन किया गया था । IUE चुनिंदा निष्क्रिय करने के लिए अनुमति देता है (या एक्सप्रेस) कुतर दिमाग में विशिष्ट जीन या उत्परिवर्तनों, corticogenesis18,19में उनकी भागीदारी के तेजी से मूल्यांकन को सक्षम करने से । RNAi मध्यस्थता-पछाड़ना या एक या एक से अधिक उंमीदवार जीन के व्यक्त करने का कारण है, जब जीन रोग विकास के साथ जुड़ा हुआ है की उंमीद है, ंयूरॉन प्रवास में स्थानीय दोषों और/ एक जीन की पहचान पर जिसकी निष्क्रियता (या एक्सप्रेस) कुतर में रोगियों में मनाया phenotype reproduces, यह एमसीडी के साथ छिटपुट रोगियों में स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार बन जाता है । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम हाल ही में C6orf70 जीन के महत्वपूर्ण योगदान का पता चला (भी ERMARDके रूप में जाना जाता है) रोगियों में PNH रोगजनन में पोस 6q27 गुणसूत्र विलोपन16।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमसीडी बौद्धिक विकलांगता के महत्वपूर्ण कारण है और दवा के 20-40% के लिए खाते में प्रतिरोधी बचपन मिर्गी1,2। एमसीडी में ब्याज दो प्रमुख कारकों का एक परिणाम के रूप में पिछले एक दशक में नाट?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ जी McGillivray, पीआर जे क्लेटन-स्मिथ, पीआर W.B. Dobyns, पीआर. पी. Striano, पीआर. ie Scheffer, पीआर. सपा Roberston और पीआर S.F. Berkovic एमसीडी रोगियों को उपलब्ध कराने के लिए धंयवाद । हम तकनीकी सलाह और मदद के लिए डॉ एफ मिशेल और डी मेई धंयवाद । यह काम यूरोपीय संघ के सात फ्रेमवर्क कार्यक्रम से धन द्वारा समर्थित किया गया था, इच्छा परियोजना, अनुबंध संख्या: स्वास्थ्य-F2-602531-2013, (को विद्याचरण, r, A.R., A.F. और सीसी), INSERM (को A.R. और सीसी), शौकीनों Jérôme Lejeune (R13083AA को ए. एफ., ई. पी. पी और सी. सी.) और Région Provence Alpes कोटे azur (APO2014-अवनती को सीसी और ए. ए. डी.). D. A. K एक EMBO जवान अन्वेषक है और FWF पलाश (I914 and P24367) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
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