En ny strategi kombinera Array-CGH, hela-exome sekvensering och In Utero elektroporation hos gnagare att identifiera orsakande gener för hjärnan missbildningar

Summary

Periventrikulär nodulär heterotopia (PNH) är den vanligaste formen av missbildning av kortikala utveckling (MCD) i vuxen ålder men dess genetiska grunden förblir okänd i mest sporadiska fall. Vi har nyligen utvecklat en strategi att identifiera nya kandidatgener för MCDs och direkt bekräfta deras orsakande roll i vivo.

Abstract

Fosterskador som involverar hjärnbarken – kallas även missbildningar av kortikala utveckling (MCD) — är viktiga orsaker till utvecklingsstörning och står för 20-40% av läkemedelsresistent epilepsi i barndomen. Högupplösta hjärnavbildning har underlättat i vivo identifiering av en stor grupp av MCD fenotyper. Trots framsteg inom hjärnavbildning, genomanalys och generering av djurmodeller saknas ett enkelt arbetsflöde att systematiskt prioriterar kandidatgener och testa funktionella effekter av förmodad mutationer. För att lösa detta problem, var en experimentell strategi som möjliggör identifiering av romanen orsakande gener för MCD utvecklats och validerats. Denna strategi är baserad på identifierande kandidat genomisk regioner eller gener via array-CGH eller hela-exome sekvensering och karaktärisera effekterna av deras inaktivering eller överuttryck av specifika mutationer utveckla gnagare hjärnan via i utero elektroporation. Denna metod ledde till identifiering av genen C6orf70 , som kodar för en förmodad vesikulär protein, till patogenesen av periventrikulär nodulär heterotopia, en MCD som orsakas av defekta neuronala migration.

Introduction

Hjärnbarken spelar en nyckelroll i kognitiva och intellektuella processer och är involverad i emotionell kontroll samt inlärning och minne. Det är därför inte förvånande att många neurologiska och psykiatriska sjukdomar resultera från missbildningar av kortikala utveckling (MCD). Etiologin till MCD är komplex eftersom både förvärvade och genetiska faktorer är inblandade. Den kumulativa förekomsten av genetiskt bestämd andel MCD är ca 2% och de är sporadiska i de flesta fall. Till exempel incidensen av medfödda hjärna missbildning uppskattades vara högre än 1% i den mänskliga befolkningen, och vissa former av MCD observeras i mer än 14% av alla patienter med epilepsi och hos 40% av svår eller svårbehandlad epilepsi^{1, 2}.

Periventrikulär nodulär Heterotopia (PNH) är en av de vanligaste MCDs och orsakas av onormal migration av nervceller från ventrikulära zonen (VZ) att utveckla hjärnbarken. Fel i nervceller att migrera resultat i kluster av heterotop nervceller längs väggarna i de laterala ventriklarna som vanligtvis kan visualiseras med hjälp av magnetisk resonanstomografi (MRT). Kliniska, anatomiska och imaging funktioner i PNH är heterogena. Noduli varierar från små och ensidiga bilateral och symmetrisk. Vanliga kliniska följdtillstånd inkluderar epilepsi och intellektuella funktionshinder³. Mutationer i genen Filamin A (eller FLNAEN), som kartor i Xq28, hittades i 100% av familjer med X-länkade bilaterala PNH och hos 26% av sporadiska patienter^3,4. En sällsynt, recessiv form av PNH orsakas av mutationer i genen ARFGEF2 , som kartor i 20q13, har rapporterats i två consanguineous familjer⁵. Biallelic mutationer i gener som kodar för receptorn-ligand cadherin para DCHS1 och FAT4 har nyligen upptäckts i nio patienter som drabbas av en multisystemisk sjukdom som inkluderar PNH⁶. PNH har också associerats med skör X syndrom⁷, Williams syndrom⁸, 22q11 microdeletion syndrom⁹, dubletter på 5 p 15¹⁰, borttagningar på 1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6 p 25¹³ och 6q terminal radering syndrom^{14,15,16,17,18,19}, vilket tyder på att ytterligare orsakande gener är utspridda hela genomet. För cirka 74% av sporadiska PNH-patienter återstår emellertid den genetiska grunden vara klarlagd¹⁷.

Klassiskt gene mappning metoder såsom array jämförande genomisk hybridisering (array-CGH) har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för detektion av sub mikroskopiska kromosomavvikelser, men Regionkommittén genomisk identifieras med hjälp av denna metod är ofta stora och innehåller många gener.

Tillkomsten av massiva parallella sekvensering tekniker (dvs. hela-Exome sekvensering (WES) och Whole-Genome sekvensering (WGS)) har avsevärt minskat både kostnaden och tidsåtgången att sekvensera en hela mänskliga exome eller genomet. Tolkning av WES och WGS data är dock fortfarande utmanande i flesta fall, sedan för varje patient tiotals till hundratals (eller ens tusentals, beroende från vilken typ av analys) varianter ur datafiltrering.

För att påskynda processen att identifiera roman MCD orsakande gener, en roman systematisk strategi som kombinerar array-CGH, var WES och Utero elektroporation (IUE) screening av kandidatgener utformad. IUE gör det möjligt att selektivt inaktivera (eller överuttrycka) specifika gener eller mutationer i gnagare hjärnor, möjliggör snabb utvärdering av deras deltagande i corticogenesis^18,19. RNAi medierad-knockdown eller överuttryck av en eller flera kandidatgener förväntas orsaka, när genen associeras med sjukdomsutvecklingen, lokaliserade defekter i neuronala migration och/eller mognad. Efter identifiering av en gen vars inaktivering (eller överuttryck) återger den fenotyp som observerats hos patienter i gnagare, blir det en enastående kandidat för screening i sporadiska patienter med MCD. Använder denna metod, avslöjat vi nyligen den C6orf70 genen (även känd som ERMARD) avgörande bidrag i PNH patogenesen hos hysande 6q27 kromosomala borttagningar¹⁶.

Protocol

Etik uttalande: Wistar råttor var parad, underhålls och används i INMED djur anläggningar, i samförstånd med Europeiska unionen och franska lagstiftningen. 1. DNA-extraktion och kvantifiering för Array-CGH och WES Extrahera genomiskt DNA (gDNA) från humanblod leukocyter från patienter med hjälp av en automatiserad DNA isolering robot eller kommersiellt tillgängliga manuell DNA extraktion kit enligt tillverkarens protokollet. Kvantifiera alla prover med en spektrofotometer….

Representative Results

Den experimentella strategi som syftar till att identifiera nya MCD orsakande gener är återgetts i figur 1. Genom att utföra array-CGH i en kohort av 155 patienter med utvecklande hjärnan avvikelser steglöst kombinerar PNH (figur 2A), corpus callosum missbildning, colpocephaly, cerebellär hypoplasi och polymicrogyria som är associerad med epilepsi, ataxi och kognitiv svikt, identifierade …

Discussion

MCDs är viktiga orsaker till utvecklingsstörning och står för 20-40% av resistenta barndom epilepsi^1,2. Intresset för MCDs har ökat dramatiskt det senaste decenniet som en följd av två huvudfaktorer. Först är förbättringen i hjärnavbildning (särskilt MRT), som tillåter läkare och forskare att visualisera många missbildningar i hjärnan som inte tidigare kändes igen. Den andra är utvecklingen av genetiska verktyg som har tillåtit identifiering …

Materials

Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine