Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

Summary

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.

Abstract

Malformations congénitales qui impliquent le cortex cérébral — aussi connu sous le nom des malformations du développement cortical (MCD) — sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % des épilepsies pharmacorésistantes dans l’enfance. L’imagerie cérébrale à haute résolution a facilité en vivo l’identification d’un grand groupe de phénotypes MCD. Malgré les progrès de l’imagerie cérébrale, de l’analyse génomique et de génération de modèles animaux, un workflow simple d’accorder systématiquement la priorité gènes candidats et pour tester les effets fonctionnels de mutations putatives est manquant. Pour contourner ce problème, une stratégie expérimentale permettant d’identifier de nouveaux gènes pour MCD a été développée et validée. Cette stratégie repose sur l’identification des régions génomiques candidat ou gènes via CGH-array ou ensemble-l’exome séquençage et de caractériser les effets de leur inactivation ou de la surexpression de mutations spécifiques dans le développement de cerveau rongeurs via in utero électroporation. Cette approche a conduit à l’identification du gène C6orf70 , codant pour une protéine vésiculaire, à la pathogenèse de la leucomalacie hétérotopie nodulaire, un MCD causé par la migration neuronale défectueuse.

Introduction

Le cortex cérébral joue un rôle clé dans les processus cognitifs et intellectuels et est impliqué dans la mémoire comme apprentissage et contrôle des émotions. Il n’est donc pas étonnant que beaucoup de maladies neurologiques et psychiatriques résulte des malformations du développement cortical (MCD). L’étiologie de la MCD est complexe puisque tous deux acquis et les facteurs génétiques sont impliqués. La prévalence cumulée de proportion déterminée génétiquement de MCD est d’environ 2 %, et ils sont sporadiques dans la plupart des cas. Par exemple, l’incidence de la dysgénésie cérébrale congénitale a été estimée à plus de 1 % dans la population humaine, et certaines f....

Protocol

Énoncé d’éthique : Des rats Wistar ont été accouplés, entretenus et utilisés dans les animaleries Invest in Med, en accord avec la législation de l’Union européenne et les Français.

1. ADN Extraction et Quantification de CGH-Array et WES

1. Extraire l’ADN génomique (ADNg) de leucocytes du sang humain provenant de patients à l’aide d’un robot automatisé d’isolement ADN ou trousses manuels disponibles dans le commerce d’extraction d’ADN selon le protocole du fabricant. Quantifier tous les échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre.

2. tableau-CGH protocole

1. Digestion de restriction ....

Results

La stratégie expérimentale conçue pour identifier de nouveaux gènes causatifs MCD est récapitulée dans la Figure 1.

En effectuant la CGH-array dans une cohorte de 155 patients présentant des anomalies de développement de cerveau combinant variablement PNH (Figure 2 a), dysgénésie du corps calleux, colpocéphalie, hypoplasie du cervelet et polymicrogyria associées à l’épilepsie, ataxie et troubles.......

Discussion

MCDs sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % de l’enfance pharmacorésistant épilepsie^1,2. Intérêt pour MCDs a considérablement augmenté ces dix dernières années grâce à deux facteurs principaux. Le premier est l’amélioration dans d’imagerie cérébrale (en particulier l’IRM), qui permet de visualiser de nombreuses malformations du cerveau qui n’étaient pas précédemment reconnues de médecins et de scientifiques. L’autre .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Systèmes de distribution par micro-injection intracellulaire
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green permet une surveillance visuelle de l’injection
BTX ECM 830 Électroporateur	BTX Harvard Apparatus	45-0002	L’ECM 830 est un générateur d’impulsions à ondes carrées conçu pour les applications
in vitro et in vivoMicrotome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz avec lame vibrante
FluoView 300	Olympus		L’Olympus FluoViewTM 300 est un microscope confocal à balayage laser à balayage ponctuel, à détection de points, conçu pour l’application de recherche
en biologie Logiciel eCELLence	Glance Vision Technologies		eCELLence est un logiciel conçu pour l’analyse quantitative de la migration cellulaire
Agilent Microarray Scanner Bundle			Lames
pour 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K ou 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA ou G2565BA
pour 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K ou 8 x 60K	Agilent	G4900DA ou G2565CA
Chambre d’hybridation, acier inoxydable	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chambre pour hybridation
CGH en réseauHybridation Lames d’étanchéité de la chambre, paquet			joints pour puces CGH
pour puces à 1 paquet ou	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
pour les puces à 2 paquets ou	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
pour les puces à 4 ou	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
pour les puces à lot de 8	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Four d’hybridation	Agilent	Agilent p/n G2545A
Rotateur de four d’hybridation pour chambres d’hybridation de microarrays	Agilent Agilent	p/n G2530-60029
Thermocycleur avec couvercle chauffant	Agilent	Agilent p/n G8800A ou équivalent	Termal cycleur pour incubations
1,5 mL Tube de microfuge sans RNase	Ambion	p/n AM12400 ou équivalent	Microcentrifugeuse
Barre d’agitation magnétique	Corning	p/n 401435 ou équivalent	Instrument d’agitation
Fluorimètre Qubit Life	Technologies	p/n Q32857	Instrument de quantification de l’ADN
Kit de dosage Qubit dsDNA BR, à utiliser avec le fluorimètre	Qubit Invitrogen	p/n Q32850	Kit pour fluorimètre Qubit
UV-VIS spectrophotomètre	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 ou 2000, ou équivalent	Instrument pour la quantification de l’ADN
P10, P20, P200 et P1000 pipettes	Pipetman ou équivalent		d’ADN
Concentrateur sous vide	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 ou équivalent	Instrument pour concentrer l’ADN
SureTag Kit complet d’étiquetage de l’ADN	Agilent	p/n 5190-4240	Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Colonnes de purification (50 unités)	Agilent	p/n 5190-3391	Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
AutoScreen A, plaques 96 puits	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Kit de nettoyage PCR GenElute	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Génomique humaine ADN		p/n G1521	Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Pour microréseaux CGH :	Promega	(femelle) ou p/n G1471 (mâle)	Réseau CGH contrôle ADN
Pour les microréseaux CGH+SNP :	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 ou NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit ou	Agilent	p/n 5188-5226	Hybridation et lavage CGH
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 et	Agilent	p/n 5188-5221	Hybridation et lavage Oligo
aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridation et lavage
Solution de stabilisation et de séchage	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridation et lavage
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit d’hybridation	Agilent	p/n 5188-5220 (25) ou p/n 5188-5380 (100)	Hybridation et lavage CGH
Electrique Cot-1	Agilent	p/n 5190-3393	Hybridation et lavage CGH
Agilent C	Agilent		Scanner pour lames CGH
SureSelect XT2 Kit de réactifs			Kit pour enrichissement cible
Plate-forme HiSeq (HSQ), 16 Échantillons	Agilent	p/n G9621A
Plate-forme HiSeq (HSQ), 96 échantillons	Agilent	p/n G9621B
Plate-forme HiSeq (HSQ), 480 échantillons	Agilent	p/n G9621C
Plate-forme MiSeq (MSQ), 16 échantillons	Agilent	p/n G9622A
Plate-forme MiSeq (MSQ), 96 échantillons	Agilent	p/n G9622B
Plate-forme MiSeq (MSQ), 480 échantillons	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit pour la séparation, le dimensionnement et la quantification de fragments d’ADNdb de 25 à 1000 pb.
Kit ADN haute sensibilité	Agilent	p/n 5067-4626	Kit pour l’analyse d’ADN fragmenté ou de banques d’ADN.
		AMPure XP	Kit pour la purification PCR automatisée.
5 mL	Agencourt	réf. A63880
60 mL	Agencourt	réf. A63881
450 mL	Agencourt	réf. A63882
Dynabeads MyOne Streptavidine T1			Isolement et manipulation des acides nucléiques biotinylés
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Kit de dosage Quant-iT dsDNA BR, pour le fluorimètre			Quantification de l’ADN
100 dosages, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 dosages, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit tubes de dosage	Life Technologies	p/n Q32856	Quantification de l’ADN
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	en fonction de l’expérience	Kit pour la capture des bibliothèques
SureCycler 8800 Thermocycleur	Agilent	p/n G8800A	Amplification de l’ADN
Module de plaque à 96 puits pour SureCycler 8800 Thermocycleur	Agilent	p/n G8810A	Amplification de l’ADN
compatible SureCycler 8800 Plaques à 96 puits Agilent		p/n 410088	Amplification de l’ADN
Bande optique capuchons	Agilent	p/n 401425	Amplification de l’ADN
Bandes de capuchon de tube, bombées	Agilent	p/n 410096	Amplification de l’ADN
Tapis de compression	Agilent	p/n 410187	Amplification de l’ADN
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	Amplification de l’ADN
2100 Bioanalyseur Kit d’électrophorèse	Agilent	p/n G2947CA	Amplification de l’ADN
Système de préparation d’échantillons Covaris, série E ou série S	Cisaillement d’ADN	Covaris
Porte-échantillons		réf. 520078	cisaillement de l’ADN
Mélangeur à plaques Nutator	BD Diagnostics	p/n 421105 ou équivalent	Mélangeur à plaques
GaIIx	Illumina		machine de séquençage de nouvelle génération