Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau
Summary
Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.
Abstract
Malformations congénitales qui impliquent le cortex cérébral — aussi connu sous le nom des malformations du développement cortical (MCD) — sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % des épilepsies pharmacorésistantes dans l’enfance. L’imagerie cérébrale à haute résolution a facilité en vivo l’identification d’un grand groupe de phénotypes MCD. Malgré les progrès de l’imagerie cérébrale, de l’analyse génomique et de génération de modèles animaux, un workflow simple d’accorder systématiquement la priorité gènes candidats et pour tester les effets fonctionnels de mutations putatives est manquant. Pour contourner ce problème, une stratégie expérimentale permettant d’identifier de nouveaux gènes pour MCD a été développée et validée. Cette stratégie repose sur l’identification des régions génomiques candidat ou gènes via CGH-array ou ensemble-l’exome séquençage et de caractériser les effets de leur inactivation ou de la surexpression de mutations spécifiques dans le développement de cerveau rongeurs via in utero électroporation. Cette approche a conduit à l’identification du gène C6orf70 , codant pour une protéine vésiculaire, à la pathogenèse de la leucomalacie hétérotopie nodulaire, un MCD causé par la migration neuronale défectueuse.
Introduction
Le cortex cérébral joue un rôle clé dans les processus cognitifs et intellectuels et est impliqué dans la mémoire comme apprentissage et contrôle des émotions. Il n’est donc pas étonnant que beaucoup de maladies neurologiques et psychiatriques résulte des malformations du développement cortical (MCD). L’étiologie de la MCD est complexe puisque tous deux acquis et les facteurs génétiques sont impliqués. La prévalence cumulée de proportion déterminée génétiquement de MCD est d’environ 2 %, et ils sont sporadiques dans la plupart des cas. Par exemple, l’incidence de la dysgénésie cérébrale congénitale a été estimée à plus de 1 % dans la population humaine, et certaines formes de MCD sont observées dans plus de 14 % des patients souffrant d’épilepsie et dans 40 % des épileptiques graves ou réfractaires1, 2.
Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est l’un de la plus commune MCDs et est causée par une migration anormale des neurones de la zone ventriculaire (VZ) pour le cortex cérébral en voie de développement. L’échec des neurones pour migrer les résultats en amas de neurones hétérotopiques le long des parois des ventricules latéraux qui peuvent habituellement être visualisées à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Les caractéristiques cliniques, anatomiques et d’imagerie de la PNH sont hétérogènes. Nodules peuvent varier de petites et unilatérale à bilatérale et symétrique. Des séquelles cliniques communs concernent l’épilepsie et intellectuel handicap3. Des mutations du gène Filamine A (ou FLNA), qui correspond en Xq28, trouvées chez 100 % des familles avec l’HPN bilatérale liée à le X et dans 26 % des patients sporadique3,4. Une forme récessive rare de PNH causée par des mutations dans le gène ARFGEF2 , qui correspond à 20q13, a été signalée dans deux familles consanguines5. Récemment, des mutations bialléliques gènes codant pour la paire de cadhérine récepteur-ligand DCHS1 et saturées4 ont été identifiées chez neuf patients touchés par une maladie multisystémique qui comprend6de la PNH. PNH a également été associé fragile X syndrome7, Williams syndrome8, de syndrome microdélétion 22 q 119, duplications à 5 p 1510, destructions à 1P 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 et 6 q délétion terminale syndrome14,15,16,17,18,19, ce qui suggère que les gènes supplémentaires sont dispersés dans l’ensemble du génome. Cependant, environ 74 % de patients PNH sporadiques le fondement génétique reste à être élucidé17.
Les approches de cartographie génétique classique tels qu’array hybridation génomique Comparative (CGH-array) se sont avérés pour être des outils puissants pour la détection des anomalies chromosomiques submicroscopique, cependant, les régions génomiques identifiées à l’aide de cette approche sont souvent de grande taille et contiennent de nombreux gènes.
L’avènement des techniques de séquençage parallèle massive (c.-à-d. séquençage de l’Exome-ensemble (WES) et Whole-Genome séquençage (WGS)) a considérablement réduit le coût et le temps requis pour séquencer un ensemble humain exome ou du génome. Interprétation des données de l’EMTE et gt reste néanmoins difficile dans la plupart des cas, depuis, pour les variantes de chaque patient des dizaines à des centaines (ou même des milliers, en fonction du type d’analyse) émergent du filtrage des données.
Pour accélérer le processus d’identification de nouveaux gènes MCD, une stratégie systématique novatrice alliant CGH-array, WES et in utero électroporation (IUE) de dépistage des gènes candidats a été conçu. IUE permet de désactiver sélectivement (ou surexpriment) des gènes spécifiques ou des mutations dans les cerveaux de rongeurs, ce qui permet une évaluation rapide de leur implication dans l’exocytosis18,19. Arni médié-knockdown ou la surexpression d’un ou plusieurs gènes candidats devrait entraîner, quand le gène est associé de développement de la maladie, de défauts localisés de la migration neuronale et/ou de maturation. Lors de l’identification d’un gène dont l’inactivation (ou surexpression) reproduit le phénotype observé chez les patients chez les rongeurs, il devient un candidat exceptionnel pour le dépistage chez les patients sporadiques avec MCD. En utilisant cette approche, nous avons récemment révélé la contribution essentielle du gène C6orf70 (également connu sous le nom ERMARD) dans la pathogenèse de la PNH chez les patients abritant de destructions chromosomiques en 6 q 2716.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCDs sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % de l’enfance pharmacorésistant épilepsie1,2. Intérêt pour MCDs a considérablement augmenté ces dix dernières années grâce à deux facteurs principaux. Le premier est l’amélioration dans d’imagerie cérébrale (en particulier l’IRM), qui permet de visualiser de nombreuses malformations du cerveau qui n’étaient pas précédemment reconnues de médecins…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, PR. c’est-À-dire Scheffer, Pr. S.P. Roberston et PR. S.F. Berkovic pour fournir aux patients de la MCD. Nous remercions le Dr F. Michel et D. Mei pour aide et conseils techniques. Ce travail a été financé par le Programme-cadre de l’UE, sept projets de désir, le numéro de contrat : santé-F2-602531-2013, (à V.C., R.G., A.R., A.F. et C.C.), INSERM (à A.R. et C.C.), la Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA A.F, E.P.P et C.C.) et Région Provence Alpes Côte d’Azur (APO2014 – DÉMOTIQUE C.C. et A.A.D). D.A.K est un EMBO Young Investigator et est soutenu par la FWF accorde (I914 et P24367).
Materials
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
- Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
- Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
- Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
- Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
- Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
- Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
- Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
- Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
- van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
- Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
- Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
- Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
- Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
- Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
- Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
- Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
- Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
- Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
- Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
- Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
- Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).
