Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Ein umfassendes Verständnis der Signalwege erfordert detailliertes Wissen über die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Die meisten Methoden zur Beurteilung der Wechselwirkung eines bestimmten Liganden mit seinem spezifischen Rezeptor sind teuer, zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordern eine spezielle Ausrüstung und Know – how 1.
Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und zuverlässige Punkt-für-Punkt-Protokolle den Liganden-Rezeptor-Interaktion an ein Enzym linked immunosorbent assay (ELISA) basieren, zu untersuchen: den direkten Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung-Assay (LRA) und den Wettbewerb LRA. ELISA ist ein sehr empfindlich, spezifisch und leicht verfügbare Technik routinemäßig in fast jedem Labor eingesetzt. ELISA kann in verschiedener Weise durchgeführt und angepasst werden. Die vorgestellten Protokolle werden für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen lambda Interferone (INFLs) und deren Rezeptor optimiert.
Die direkte LRA ermöglicht eine quantificatiauf der Ligand-Rezeptor in Bezug auf Ligandenkonzentration Bindung und somit eine Bindungskurve ergibt. Verwendung eines geeigneten Modells für den Liganden-Rezeptor – Interaktion können die Daten analysiert werden , weiter die Dissoziationskonstante (K D) zu schätzen.
In dem vorgestellten Protokoll wird die allgemein verwendete Hill-Gleichung, die Ligand-Rezeptor-Bindung an Modell angewendet. Obwohl andere Verfahren wie beispielsweise die Oberflächenplasmonresonanz – Technologie 2,3 die Bestimmung der Bindungsaffinitäten zwischen zwei Proteinen zu ermöglichen, ist diese Technik oft arbeitsintensiv, teuer und erfordert eine spezielle Laborausrüstung.
Der Wettbewerb LRA ermöglicht das Screening von inhibitorischen Peptide: Die Ligand-Rezeptor-Bindung wird in Bezug auf Peptidkonzentration quantifiziert. Dies ergibt eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die die hemmende Wirkung des Peptids beschreibt. Die Daten können weitere 50 die Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC abzuschätzen analysiert werden </sub>) des Blockierungspeptids.
Beide ELISA-Protokolle sind einfach zu bedienen und kann auf ein breites Spektrum an Forschungsfragen angepasst werden. Rekombinante Proteine jeglicher Art verwendet werden, um zuverlässig und schnell die Wechselwirkungsteile bestimmen. Darüber hinaus kann der Wettbewerb LRA verwendet werden, um kritische Interaktionsstellen von Liganden und Rezeptoren zu bestimmen durch Verwendung von blockierenden Peptiden, die ausgelegt sind, entweder den Liganden oder den Rezeptor zu imitieren. Wenn das Blockierungspeptid effiziente und spezifische Hemmung zeigt, nimmt das Peptid eine kritische Interaktionsstelle des Liganden (wenn das Peptid-Mimetika der Rezeptor) oder des Liganden (wenn das Peptid-Mimetika der Ligand).
Das erste Protokoll der K D -Wert Bestimmung verschiedener INFLs beschreibt und die alpha – Untereinheit von ihrer Rezeptor, dh der Interleukin-28 – Rezeptor (IL28RA) die direkte LRA verwenden. Als nächstes zeigt das zweite Protokoll, wie die Fähigkeit eines langen Peptid 20 Aminosäuren zu bestimmen,die INFL-IL28RA Wechselwirkungen hemmen. Das Peptid wurde entwickelt mit IFNLs an ihren Rezeptor-Bindungsstelle konkurrieren, und ermöglicht somit ein Molekular Verständnis der Wechselwirkung. Darüber hinaus kann dieses Peptid verwendet werden IL28RA in in vitro – Experimenten zu blockieren , die Auswirkungen auf nachgeschalteten Signaleffekte 4 zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA ist ein Standard und gut etablierte Methode für viele Laboratorien. Wir haben weiter modifiziert und verbessert eine zuvor Methode 5,7 veröffentlicht. Die aufgezeigte Schritt- für -Schritt – Protokoll zeigt , wie es in einfacher Weise verwendet werden können , um die K d -Werte von Ligand-Rezeptor – Wechselwirkungen zu bestimmen. Darüber hinaus ist die IC50 eines Blockierungspeptid, das bestimmt werden kann, mit dem Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung stört.
We…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochimie. 35, 6786-6794 (1996).
