Meiotisk Spindel Vurdering i Mouse Oocytter av siRNA-mediert lyddemping
Summary
Her presenterer vi en protokoll for spesifikke siRNA-mediert mRNA uttømming fulgt av immunofluorescensanalyse å evaluere meiotisk spindelenheten og organisasjon i mus oocytter. Denne protokollen er egnet for in vitro uttømming av vitnemål og funksjonell vurdering av ulike spindel og / eller MTOC-tilknyttede faktorer i eggceller.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
Meiose er en unik divisjon prosess som skjer i kjønnscellene (egg og sperm) og innebærer to delin uten å gripe DNA syntese å skille homologe kromosomer og søsterkromatider under meiose-I og meiose-II, henholdsvis 1. Feil i kromosom segregering under meiotisk divisjon i ubefruktede egg kan resultere i Aneuploidy, som er arvet av fosteret under befruktning. Spesielt var forekomsten av Aneuploidy i utviklings embryoer øker med stigende mors alder og er en viktig årsak til medfødte misdannelser samt graviditet tap på kvinner 1,2, altså, understreker et viktig behov for å forstå den molekylære grunnlaget for Aneuploidy under meiotisk divisjon .
Under celledeling, er avgjørende avhengig montering av microtubule spindelapparatet og etablering av stabile kromosom-microtubule interaksjoner for riktig vedlegg til motsatt spindel kromosom segregeringpolene. Viktigere, meiotisk spindel formasjonen i pattedyr oocytter skiller seg fra mitose i somatiske celler, og er regulert av unike mikrotubul organiserende sentre (MTOCs) som mangler Sentrioler 3,4. Essensielle proteiner som er nødvendige for microtubule kimdannelse og organisering lokalisere til oocytten MTOCs, inkludert γ-tubulin som katalyserer microtubule montering. I tillegg pericentrin fungerer som en viktig stillas protein, som binder og ankere y-tubulin så vel som andre faktorer på MTOCs 5. Spesielt våre studier viser at uttynning av nøkkel MTOC-assosierte proteiner forstyrrer meiotisk spindel organisasjon og fører til kromosom segregering feil i ubefruktede egg, som ikke er fullt ut løses av spindelenheten sjekkpunkt (SAC) 6,7. Derfor mangler i spindel stabilitet, som ikke utløser meiotisk arrest, utgjøre en betydelig risiko i å bidra til Aneuploidy. Til tross for sin avgjørende rolle i spindelenheten og organisasjon, eggcelle MTOC protein komposisjon og funksjonen er fortsatt dårlig forstått.
Å teste funksjonen av spesifikke target-proteiner i pattedyr oocytter er krevende, ettersom cellene blir transkripsjonelt hvilende kort tid før gjenopptakelse av meiose 8,9. Derfor preovulatoriske eggceller stole på mors mRNA butikker å gjenoppta meiose og støtte meiotisk divisjon samt de første cleavage divisjoner etter befruktning 10,11. Effekten av RNA-interferens (RNAi) mediert degradering av mRNA transkripter i pattedyr ubefruktede egg er godt etablert og mødre RNA rekruttert for oversettelse under meiotisk modning er spesielt mottagelig for siRNA målgruppe 12-14. Derfor mikroinjeksjon av korte interfererende RNA (siRNAs) inn oocytter gir en verdifull tilnærming til å utarme målet mRNAs for funksjonell testing.
Her beskriver vi fremgangsmåter for isolering av muse-oocytter og siRNA-mediert nedbrytning av spesifikk transcripts å teste funksjonen av en essensiell MTOC-assosiert protein, pericentrin. I tillegg har vi beskrive immunfluorescens analyse forhold til å evaluere meiotisk spindel formasjonen i oocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om det finnes flere metoder for eksogen nukleinsyre overføring inn i somatiske celler, som for eksempel elektroporering og transfeksjon, mikroinjeksjon er den optimale fremgangsmåten for levering av RNA-molekyler inn i transkripsjonelt hvilende muse-oocytter. Den nåværende protokollen gir en effektiv tilnærming for in vitro uttømming av spesifikke mRNA som muliggjør funksjonstesting av ulike spindel og / eller MTOC-tilknyttede faktorer i eggceller. Denne tilnærmingen resulterer i effektiv transkrip…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
