This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
세포 분열 동안 게놈의 평등 분리는 복제 된 DNA와 스핀들 미세 소관 사이의 올바른 상호 작용을 필요로한다. 미세 소관은 물리적으로 동원체 1로 알려진 동원체에 조립 단백질의 앙상블을 통해 염색체와 상호 작용합니다. 염색체의 정확한 분포는 자매 kinetochores가있는 각 자매가 반대 스핀들 극에서 발생하는 미세 소관과 관련된, bioriented되어 있어야합니다. 동원체의 미세 소관은 (는 KT-MT) bioriented 형태가 아닌 첨부 신속하고 효율적으로 오류 정정으로 알려진 프로세스에서 biorientation을 확립 할 수있는 기회를 제공하기 위해 불안정화된다. 이전에 포유 동물 세포에 설립되었습니다 오류 정정 분석 5 (키네신-5) Eg5에 대해 가역 작은 분자 억제제를 사용하여 모노 폴라 스핀들 조립이 필요합니다. 약물 치료는 잘못된 syntelic 첨부 파일의 다수를 생성하는 봇에시간 자매 kinetochores는 같은 스핀들 극에 연결합니다. 약물의 후속 세척는 에러 정정 프로세스의 시각화를 허용한다. 에러 정정 분석은 오 KT-MT 첨부 보정에 후보 단백질의 기여를 연구하는 소분자 억제제 또는 knockdowns의 존재 하에서 수행 될 수있다.
살아있는 세포에서 오류 정정을 시각화하는 능력은 더 복잡한 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 대부분의 세포주에 존재하는 염색체의 다수의 개별 KT-MT 첨부 관찰에 도전 포즈. 그들은 적은 4와 같은 염색체 6 있지만의 소분자 저해제를 포함로서 초파리 S2 세포는 에러 정정 분석을 가하는 것이 이상적 이러한 S-틸 L 시스테인 (STLC)로 키네신 5, 7-9 monastrol는 초파리 세포에서 스핀들 어셈블리 또는 키네신-5 운동 기능에 영향을주지 않습니다. 따라서 우리는 장군테드 키네신-5 억제제에 민감 유도 성 프로모터에서 인간의 키네신-5 표현하는 초파리 S2 세포주. 이 프로토콜은 내인성 초파리 키네신 -5- 동족체, Klp61F를 녹다운 및 세포 기반 에러 정정 분석에서이 세포주를 사용하는 방법을 설명한다.
오류 정정을 떠올리이 중요하고 복잡한 세포 과정에 관련된 단계를 연구하는 유용한 기술이다. 이를 위해, 잘못된 첨부 가역적 억제제를 사용하여 생성되고, 에러 정정이 약물의 유실시에 관찰된다. 이 분석은 원래 포유 동물 조직 배양 세포 (5)를 사용하여 개발되었습니다. 그러나 많은 모델 포유 동물 세포 유형에 kinetochores 다수의 존재는 각각의 에러 정정 이벤트를 관찰하는 도전 포즈. 초파리 S2 세포는 에러 정정을 관찰 그들을보다 바람직한 세포주 올라서 kinetochores의 적은 4 등의 쌍을 갖는다. 그러나, 주요 단점은 많은 억제제 초파리 S2 세포에서 효과가 있다는 것이다. 따라서, 인간 키네신 -5- 발현 인간화 초파리 S2 세포주를 생성하는 능력은 오류 정정을 연구하는 유용한 도구를 제공한다.
초파리 S2 세포가 될 수 있지만오류 정정을 연구 나은 세포주 세포주를 획득하고 필수적인 유전자를 넉다운에 관련된 여러 단계는이 기술에 일부 문제를 야기. 예를 들어, 형질 전환 효율은 매우 낮을 수있다. 세포의 20 % 미만이 Eg5-mCherry을 표현하는 경우 선택 프로세스가 오래 걸릴 같이 형질 반복한다. 또한, 두 형광 단백질을 발현하는 세포의 비율은 시간 경과에 따라 감소 될 수 있습니다. 이것은 각각 Eg5-mCherry를 발현하는 세포 및 GFP-α-tubulin에 대한 선택 블라스트 S HCl 및 하이 그로 마이신 B의 존재 하에서 세포를 분할함으로써 극복 될 수있다. 그것은 초파리 S2 세포는 사람의 단백질과에 orthologues이 점에 유의하는 것이 중요하다; 따라서, 내인성 단백질 최저 조건을 최적화하는 것이 중요하다. 최적의 최저 조건은 dsRNA에의 양 및 치료의 길이에 따라 다를 수 있습니다. 등장과의 신속한 개선을 고려 CRISPR을-Cas9은 technologi15-17 ES 인간 Eg5 대체 Klp61F 유전자 초파리 세포주의 생성 및 형질 녹다운 방식의 한계를 극복 할 수있는 강력한 대안을 제시한다. 우리의 작업은 필요 시약이 현재 개발되고있다 초파리 S2 세포에서 그렇게 비록 플라이 투 인간 유전자 여분이 경우 가능한 옵션 일 수 있음을 입증한다.
이 절차는 Eg5에 한정되지 않고, 다른 관심 단백질의 기능을 연구에 적용 할 수있다. 이전에 초파리 S2 세포에서 효과가 설립 된 억제제를 사용하는 경우,이 프로토콜은 오프 대상 효과에 대한 우려없이 살아있는 세포에서 억제제의 직접적인 영향을 연구하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여 생산 세포주는 또한 높은 처리량 스크리닝에 사용될 수있는 오류 정정에 관여하는 단백질을 표적 잠재적 약물을 식별하기 위해 분석한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 키네신-5 구조의 선물 패트리샤 워즈워스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은, 찰스 H. 후드 재단, Inc.의 TJM 및 연구비 번호 TJM에 다임 재단 3 월에서 5 FY13-205뿐만 아니라 지원에 의해 NIH 교부금 (5 R01 GM107026)에 의해 지원되었다 보스턴. TJM에
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |