This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Lik segregering av genomet under celledeling krever riktige samspillet mellom kopiert DNA og spindel mikrotubuli. Mikrotubuli fysisk samhandle med kromosomer gjennom et ensemble av proteiner som samler på sentromerer kjent som kinetochore en. Riktig fordeling av kromosomer krever at søster kinetochores er bioriented, der hver søster er assosiert med mikrotubuli som stammer fra motsatte spindel polene. Kinetochore microtubule (kt-MT) vedlegg som ikke er i bioriented konformasjon er raskt og effektivt destabilisert å gi mulighet til å etablere biorientation i en prosess som kalles feilretting. En feilkorreksjons assay som tidligere ble etablert i pattedyrceller 5 krever montering av monopolare spindler ved hjelp av reversible lavmolekylære inhibitorer mot EG5 (kinesin-5). Stoffet behandling genererer en rekke feilaktige syntelic vedlegg der both søster kinetochores feste til samme spindel pol. En etterfølgende utvasking av medikamentet tillater visualisering av feilkorreksjonsprosessen. Feilkorreksjons analysen kan utføres i nærvær av lavmolekylære inhibitorer eller knock-out for å studere bidraget av kandidat proteiner for å korrigere feilaktige kt-MT vedlegg.
Evnen til å visualisere feilkorreksjon i levende celler er et kraftig verktøy for ytterligere å forstå den molekylære mekanismen som er involvert i den komplekse prosessen. Men det store antall kromosomer til stede i de fleste cellelinjer er en utfordring i å observere individuelle kt-MT vedlegg. Drosophila S2-celler ville være ideelt for å anvende feilkorrigering assay som de inneholder så få som fire kromosomer 6, men lavmolekylære inhibitorer av kinesin 5 slik som S-trityl-L-cystein (STLC) og monastrol 7-9 påvirker ikke spindelenheten eller kinesin-5 motorisk funksjon i Drosophila celler. Vi har derfor generated et Drosophila S2-cellelinje som uttrykker humant kinesin-5 under en induserbar promoter som er følsom for kinesin-5 hemmere. Denne protokollen beskriver hvordan du knockdown den endogene Drosophila kinesin-5 homologue, Klp61F, og bruke denne cellelinjen i cellebasert feilretting analysen.
Visual feilretting er en verdifull teknikk for å studere trinnene involvert i denne viktige og komplekse cellulære prosessen. For å gjøre dette, er feilaktige vedlegg generert ved hjelp av reversible hemmere, og feilretting er observert ved utvasking av stoffet. Denne analysen ble opprinnelig utviklet ved hjelp av pattedyr vevskulturceller 5. Men tilstedeværelsen av store antall kinetochores i mange modellpattedyrcelletyper er en utfordring i å observere enkelte feilretting hendelser. Drosophila S2 celler har så få som fire par kinetochores, noe som gjør dem en mer å foretrekke cellelinje for å observere feilretting. Det er imidlertid en stor ulempe at mange inhibitorer er ineffektive i Drosophila S2-celler. Således er evnen til å generere et humanisert Drosophila S2-cellelinje som uttrykker humant kinesin-5 gir et verdifullt verktøy for å studere feilretting.
Selv Drosophila S2-celler kan være enbedre cellelinje for å studere feilretting, flere trinn involvert i å skaffe cellelinjen og slå ned viktige gener skaper noen utfordringer til denne teknikken. For eksempel kan transfeksjonseffektivitet være ganske lav. Dersom mindre enn 20% av cellene uttrykker den EG5-mCherry, bør transfeksjon gjentas som utvelgelsesprosessen vil ta lengre tid. Dessuten kan prosentandelen av celler som uttrykker begge fluorescerende proteiner reduseres over tid. Dette kan overvinnes ved å dele cellene i nærvær av Blasticidin S HCl og Hygromycin B for å selektere for celler som uttrykker EG5-mCherry og GFP-α-tubulin, respektivt. Det er også viktig å merke seg at Drosophila S2-celler har orthologues til mange humane proteiner og; Derfor er det viktig å optimalisere knockdown forholdene for de endogene proteiner. Optimale knockdown forholdene kan variere i mengden av dsRNA og lengden av behandlingen. Med tanke på fremveksten og rask forbedring av CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, presenterer generering av et Drosophila cellelinje med Klp61F genet erstattet med human EG5 et kraftig alternativ som ville overvinne begrensninger av transfeksjon og knockdown tilnærming. Vårt arbeid viser at fly-til-menneske genet erstatning bør være et levedyktig alternativ i dette tilfellet, selv om de nødvendige reagenser for å gjøre det i Drosophila S2 celler er under utvikling.
Denne fremgangsmåten er ikke begrenset til EG5, men kan anvendes for å studere funksjonen av andre proteiner av interesse. Hvis du bruker hemmere som tidligere har blitt etablert for å være ineffektive i Drosophila S2 celler, kan denne protokollen endres for å studere den direkte effekten av hemmere i levende celler uten bekymringer om målet effekter. Den cellelinje produsert ved bruk av denne protokollen kan også brukes i high-throughput screening-analyser for å identifisere potensielle medikamenter rettet mot proteiner som er involvert i feilkorrigerings.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Patricia Wadsworth for gaven av kinesin-5 konstruere. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend (5 R01 GM107026) til TJM og av Research Grant No. 5-FY13-205 fra March of Dimes Foundation til TJM, samt støtte fra Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. til TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |