CN-GELFrEE - Clear natif Gel-élué Fraction liquide Entrapment Electrophoresis
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
complexes de protéines jouent un éventail de fonctions cruciales cellulaires. Élucider leurs interactions et la dynamique non-covalentes est primordiale pour comprendre le rôle des complexes dans les systèmes biologiques. Alors que la caractérisation directe des assemblages biomoléculaires est devenu de plus en plus importante au cours des dernières années, les techniques de fractionnement indigènes qui sont compatibles avec les techniques d'analyse en aval, y compris la spectrométrie de masse, sont nécessaires pour étendre ces études. Néanmoins, le champ n'a pas de haut débit, une large gamme, méthode de séparation à haute récupération pour les assemblages de protéines natives. Ici, nous présentons fraction liquide de gel-élué électrophorèse native claire piégeage (CN-GELFrEE), qui est une nouvelle modalité de séparation pour les assemblages de protéines non-covalentes. performance de séparation CN-GELFrEE a été démontrée par des complexes de fractionnement extraits de coeur de la souris. Les fractions ont été recueillies sur 2 heures et affichées bandes discrètes allant de ~ 30 à 500 kDa. Un conmotif cohérents d'augmenter les largeurs de bande de poids moléculaire a été observée, allant chacun ~ 100 kDa. En outre, une nouvelle analyse subséquente des fractions natives par SDS-PAGE a montré poids moléculaire se déplace en accord avec la dénaturation des complexes protéiques. Par conséquent, le CN-GELFrEE a été prouvé à offrir la possibilité d'effectuer à haute résolution et à haute récupération des séparations indigènes sur des complexes de protéines à partir d'une large gamme de poids moléculaire, en fournissant des fractions qui sont compatibles avec les analyses de protéines en aval.
Introduction
La plupart des processus biologiques qui se déroulent à l' intérieur d' une cellule sont considérées comme étant réalisées par des assemblages de protéines plutôt que des protéines individuelles 1. Par conséquent, afin d'élucider le rôle biologique spécifique d'une sous – unité de la protéine dans une cellule , il est nécessaire de comprendre ses interactions avec d' autres protéines structurales ou des ligands dans les complexes 2. Cependant, l'étude des protéines nativement, le maintien de leurs interactions et de l'activité non-covalentes, reste difficile. L'un des défauts des études de la protéine native est une technique de séparation natif approprié qui est compatible avec les différentes techniques d'analyse des protéines en aval. Par conséquent, l' intérêt récent des techniques de séparation permettant de caractériser des ensembles non-covalentes de biomolécules a fortement augmenté 3.
Les techniques de séparation des protéines sont indispensables à la biochimie, la biophysique et de diverses autres études. Les techniques de séparation natives actuelles ont intrinsidéficiences c qui réduisent la compatibilité avec les analyses en aval, tels que la faible résolution, un faible débit, la perte de la précipitation, et l'exigence de grandes quantités d'échantillon initial. Tandem purification d'affinité est couramment utilisé pour les études d'interaction des protéines, mais il doit être effectué séparément pour chaque protéine cible, l' amenant à être incompatible avec l' analyse à haut débit 4. Chromatographie d'exclusion de taille 5, la précipitation sélective avec une Chromatographie d'affinité d'ions et 5 gradient de densité de séparation 6 ont tous fourni des séparations natives, mais sont en soi des techniques à basse résolution et nécessitent des quantités initiales élevées de l' échantillon.
En variante, des techniques à base de gel, comme le bleu natif (BN) et Clear natif (CN) PAGE (soit 1-D ou 2-D), écran haute résolution séparation. En outre, ce qui contraste avec les autres techniques mentionnées, les deux séparations PAGE indigènes maintiennent la solubilité et conformation native d'un large range d'espèces macromoléculaires, y compris des protéines hydrophobes. Cette capacité élargit encore la couverture du protéome atteint par ces méthodes 7,8 et est réalisée grâce à la chimie différente entre le CN et BN-PAGE. CN-PAGE repose généralement sur les détergents doux chargés comme des molécules porteuses, en remplaçant le colorant bleu de Coomassie dans BN-PAGE. BN-PAGE, mais associée à une résolution plus élevée, telles que des mises en garde a une activité enzymatique réduite dans les protéines séparées 8 et formation d' un produit d' addition d' une molécule de Coomassie, ce dernier étant fortement préjudiciable à l' aval des analyses MS 9. Ces deux méthodes, cependant, sont traditionnellement associés à une faible récupération et de la couverture du protéome étroite en raison de la coloration et les limites d'extraction de gel 7.
Pour l'étude des protéines dénaturées, il existe plusieurs techniques qui maintiennent macromolécule solubilité dans l'exercice de haute résolution fractionnement avec récupération riche en protéines et qui sont compatibles avec diVerse techniques d'analyse de protéines post-séparation. Gel-éluée Fraction liquide Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) est l'une des techniques de fractionnement qui correspondent à toutes ces caractéristiques. Cette méthode est largement appliquée dans les études à haut débit protéomique haut de bas, ce qui indique qu'il est rapide et polyvalent. En GELFrEE, les protéines sont dénaturées et séparés en fonction du poids moléculaire à travers une matrice de gel tubulaire, dont la porosité peut varier en fonction des exigences de l'échantillon et les résultats de fractionnement souhaités. Les fractions sont éluées en phase liquide, en réduisant ainsi les limitations de récupération associés à la SDS-PAGE, tout en conservant une grande résolution. Aliquotes de fractions peuvent ensuite être analysés par 1-D PAGE pour poids moléculaire sélection de bande passante 11. Il y a une forte demande pour les avantages associés à GELFrEE dans les techniques de séparation indigènes. Le procédé décrit ici, Effacer natif GELFrEE (CN-GELFrEE), est une adaptation native de GELFrEE. Afin d'être compatible avec une large spectrum des macromolécules dans leur état natif, ce procédé repose non seulement sur la NC-PAGE chimie douce, mais également une séparation par gradient de porosité, ce qui réduit la précipitation des protéines en éliminant la transition dure entre les porosités présentes dans les systèmes de gels discontinus 9. Lorsqu'il est appliqué à fractionner les complexes de protéines extraites du coeur de la souris, les fractions éluées affichent une récupération élevée et une séparation à haute résolution d'une large gamme de poids moléculaires a été obtenue. En outre, les fractions obtenues sont compatibles avec la plupart des analyses de protéines biochimique et biophysique en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN GELFrEE est dérivé du natif clair (CN) du système de mémoire tampon de page qui utilise un mélange de détergents anioniques et neutres, des molécules de support 9 , pour le fractionnement des protéines à base de masse moléculaire à travers une matrice de gel. L'application du CN GELFrEE à un extrait de protéine de cœur de souris natif généré des fractions de faible complexité avec des bandes passantes distinctes, tout en conservant des interactions non covalentes des assemblages biomo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fondation WM Keck a généreusement fourni le financement pour ce travail. Ce matériel est basé sur des travaux appuyés par la recherche FAPERJ subvention 100,039 / 2014 du gouvernement de État de Rio de Janeiro – Brésil RDM, Science sans frontières bourse 88,888,075416 / 2013-00 de la coordination pour l'amélioration de l'enseignement supérieur du personnel, sous le gouvernement du Brésil, pour HSS, la national science Foundation Graduate Research Fellowship sous le numéro de bourses 2014171659 pour OSS, et par le CNPq subvention de recherche 202011 / 2012-7 du gouvernement du Brésil pour LHFDVPCH est un destinataire de chimie de l'Université du Nord-Ouest de la vie Procédés Institut postdoctorales Bourse.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
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