CN-GELFrEE - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
タンパク質複合体は、重要な細胞機能の配列を実行します。それらの非共有結合性相互作用とダイナミクスを解明することは、生物学的システムにおける複合体の役割を理解するための最も重要です。生体分子集合体の直接的な特徴付けは近年ますます重要になってきている一方で、質量分析などの下流の分析技術、と互換性のあるネイティブの分別技術は、さらに、これらの研究を拡張するために必要です。それにもかかわらず、フィールドは、天然タンパク質のアセンブリのための高スループット、広範囲、高回収分離方式を欠いています。ここでは、非共有結合タンパク質アセンブリのための新規の分離様式である明確なネイティブゲル溶出液画分を捕捉電気泳動（CN-GELFrEE）を、提示します。 CN-GELFrEE分離性能は、マウス心臓から抽出された分画複合体によって実証されました。画分を2時間かけて収集し、〜30から500 kDaのに至るまで分離したバンドを表示されていました。詐欺分子量の帯域幅を増加させるの一貫したパターンは、各測距〜100 kDaで観察されました。また、SDS-PAGEを介して天然画分のその後の再分析は、分子量は、タンパク質複合体の変性と一致するシフトを示しました。したがって、CN-GELFrEE下流タンパク質分析と互換性のある画分を提供する、大規模な分子量範囲のタンパク質複合体の高分解能かつ高回収ネイティブ分離を実行する能力を提供することが証明されました。
Introduction
細胞内で起こって生物学的プロセスの大部分はタンパク質の集合体ではなく、単一のタンパク質1によって行われると考えられています。その結果、細胞内のタンパク質サブユニットの特定の生物学的役割を解明するためには、複合体2中の他のタンパク質またはリガンドとのその構造的な相互作用を理解することが必要です。しかし、ネイティブのタンパク質を研究し、その非共有結合性相互作用および活性を維持する、困難なままです。天然タンパク質の研究の欠点の一つは、様々な下流のタンパク質解析技術と互換性のある適切な天然の分離技術です。そのため、生体分子の非共有結合アセンブリを特徴付けることが可能な分離技術の最近の関心が急激に3に増加しています。
タンパク質分離技術は、生化学、生物物理学および種々の他の研究に不可欠です。現在のネイティブ分離技術はintrinsiを持っていますこのような低解像度、低スループット、降水量の損失、および初期試料の大量の要件として下流の分析、との互換性を減らすCの欠乏。タンデムアフィニティー精製は、一般に、タンパク質相互作用の研究のために使用されるが、それはハイスループット分析4と互換性があることが原因と、各タンパク質標的に対して別々に行わなければなりません。サイズ排除クロマトグラフィー5、全てが天然の分離を提供するが、本質的に低解像度化技術であり、高い初期サンプル量を必要としているイオンアフィニティークロマトグラフィー5及び密度勾配分離6と選択的沈殿。
あるいは、ブルーネイティブ（BN）及びクリアネイティブ（CN）PAGE（1-Dのいずれかまたは2-D）のようなゲルベースの技術は、高分解能の分離を示します。また、上記の他の技術とは対照的、両方のネイティブPAGE分離は、溶解性と幅広いRの天然のコンフォメーションを維持します疎水性タンパク質を含む巨大分子種のアンジュ。この機能は、さらに、これらの方法7,8が到達したプロテオームカバレッジを拡大し、CNおよびBN-PAGEの間で異なる化学的性質により達成されます。 CN-PAGEは、一般的にBN-PAGEでクーマシーブルー色素を交換し、キャリア分子としてソフトの荷電界面活性剤に依存しています。より高解像度に関連付けられているものの、BN-PAGEは、このような分離されたタンパク質8およびクマシー分子付加体形成における減少した酵素活性、後者の下流MSに大幅に不利である9を分析するなどの注意点があります。両方のこれらの方法は、しかしながら、伝統による染色およびゲル抽出の制限7に低い回収率および狭いプロテオームカバー率と関連しています。
変性したタンパク質の研究のために、高タンパク質回収率で高解像度の分別を行いながら、高分子の溶解性を維持し、それをdと互換性のあるいくつかの技術があります分離後、タンパク質分析技術をiverse。ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動（GELFrEE）は、すべてのこれらの特性に合わせ分別技術の一つです。この方法は、主に、それが迅速かつ汎用性であることを示し、ハイスループットトップダウンプロテオミクス研究に適用されます。 GELFrEEでは、タンパク質は変性され、管状のゲルマトリックスを介して、分子量に基づく分離の気孔率は、サンプルの要件および所望の分別結果に基づいて変更することができます。画分は、このように、高解像度を維持しながら、SDS-PAGEに関連付けられた回復の制約を低減する、液相で溶出します。画分のアリコートを、次いで、分子量帯域幅の選択11のための1次元PAGEによって分析することができます。ネイティブの分離技術でGELFrEEに関連する利点に対する高い需要があります。本明細書に記載の方法は、クリアネイティブGELFrEE（CN-GELFrEE）は、GELFrEEのネイティブ適応したものです。広幅sとの互換性を保つために、それらの天然の状態で巨大分子のpectrum、この方法は、ソフトCN-PAGE化学に関するだけでなく、不連続なゲル系9に存在する気孔率との間に過酷な遷移を排除することにより、タンパク質沈殿を低減し、気孔率勾配分離、上だけでなく、依存しています。マウスの心臓から抽出したタンパク質複合体を分画するために適用した場合、溶出画分は、高い回収率を表示し、広範囲の分子量の高分解能分離が得られました。さらに、得られた画分は、最下流の生化学的と互換性があり、生物物理学的タンパク質が分析します。
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEEは、ゲルマトリックスを介して分子に基づくタンパク質分画のための担体分子9としてアニオン性および中性界面活性剤の混合物を使用して透明なネイティブ（CN）PAGE緩衝系から誘導されます。ネイティブマウス心臓タンパク質抽出物にCN-GELFrEEの適用は、生体分子のアセンブリの非共有結合相互作用を維持しながら、個別の帯域幅で複雑性の低い画分を生成しました。 CN-PAGE?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WMケック財団は、寛大にこの仕事のための資金を提供しました。政府の下で高等教育人材の改善のためのRDMのためのブラジル、科学国境なき奨学金88888.075416 / 2013から00コーディネーションから、 – この材料リオ・デ・ジャネイロ州の政府からFAPERJの研究助成金100.039 / 2014でサポートされている作業に基づいていますOSSのためのフェローシップ番号2014171659の下HSS、国立科学財団大学院研究フェローシップのためのブラジル、の、およびLHFDVPCHのためのブラジルの政府からCNPqの研究助成金202011/2012から7によって、生命のノースウェスタン大学の化学の受信者は、研究所ポスドクを処理されていますフェローシップ賞。
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
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