CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
complejos de proteínas desempeñan una serie de funciones celulares esenciales. Elucidar sus interacciones no covalentes y dinámicas es de suma importancia para la comprensión del papel de los complejos en los sistemas biológicos. Mientras que la caracterización directa de conjuntos biomoleculares se ha convertido cada vez más importante en los últimos años, las técnicas de fraccionamiento nativos que son compatibles con técnicas de análisis de aguas abajo, incluyendo la espectrometría de masas, son necesarias para ampliar aún más estos estudios. Sin embargo, el campo carece de una, de amplio rango, método de separación de alta recuperación de alto rendimiento para ensamblajes de proteína nativa. A continuación, presentamos clara fracción líquida de gel eluida electroforesis nativa atrapamiento (CN-GELFrEE), que es una modalidad novedosa para la separación de proteínas asambleas no covalentes. rendimiento de separación CN-GELFrEE fue demostrado por los complejos de fraccionamiento extraídos del corazón de ratón. Las fracciones se recogieron durante 2 hr y se muestran bandas discretas que van desde ~ 30 a 500 kDa. Una estafase observó patrón consistente de aumentar los anchos de banda de peso molecular, cada uno que van ~ 100 kDa. Además, la posterior reanálisis de fracciones nativas a través de SDS-PAGE mostró peso molecular se desplaza de acuerdo con la desnaturalización de los complejos de proteínas. Por lo tanto, CN-GELFrEE se demostró que ofrecer la posibilidad de realizar de alta resolución y alta recuperación de separaciones nativos en los complejos de proteínas de una gama amplia de peso molecular, proporcionando fracciones que son compatibles con los análisis de proteínas aguas abajo.
Introduction
La mayoría de los procesos biológicos que ocurren dentro de una célula se cree que ser llevado a cabo por los conjuntos de proteínas en lugar de proteínas individuales 1. En consecuencia, con el fin de elucidar el papel biológico específico de una subunidad de la proteína en una célula que es necesaria para entender sus interacciones estructurales con otras proteínas o ligandos en los complejos 2. Sin embargo, el estudio de las proteínas de forma nativa, el mantenimiento de sus interacciones y la actividad no covalentes, sigue siendo un reto. Una de las deficiencias de los estudios de proteína nativa es una técnica de separación nativa adecuado que sea compatible con diversas técnicas de análisis de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, un interés reciente en las técnicas de separación capaz de caracterizar conjuntos no covalentes de biomoléculas ha aumentado considerablemente 3.
técnicas de separación de proteínas son imprescindibles para la bioquímica, la biofísica y varios otros estudios. técnicas de separación nativos actuales tienen intrinsic deficiencias que reducen la compatibilidad con los análisis posteriores, como la baja resolución, de bajo rendimiento, pérdida de la precipitación, y la exigencia de grandes cantidades de muestra inicial. Purificación por afinidad en tándem se utiliza comúnmente para estudios de interacción de proteínas, pero tiene que ser llevado a cabo por separado para cada proteína diana, provocando que sea incompatible con el análisis de alto rendimiento 4. Cromatografía de exclusión de tamaño 5, precipitación selectiva con cromatografía de afinidad por iones y 5 en gradiente de densidad de separación 6 todos se han proporcionado separaciones nativas, sino que son inherentemente técnicas de baja resolución y requieren altas cantidades iniciales de la muestra.
Alternativamente, las técnicas a base de gel, como el azul nativo (BN) y Clear Native PAGE (CN) (ya sea 1-D o 2-D), muestran la separación de alta resolución. Por otra parte, en contraste con otras técnicas mencionadas, ambas separaciones PAGE nativos mantienen la solubilidad y la conformación nativa de un amplio range de especies de macromoléculas, incluyendo proteínas hidrófobas. Esta capacidad amplía aún más la cobertura proteoma alcanzado por estos métodos 7,8 y se logra a través de diferentes química entre CN y BN-PAGE. NC-PAGE se basa comúnmente en detergentes cargados suave como moléculas portadoras, en sustitución del colorante azul de Coomassie en BN-PAGE. BN-PAGE, aunque asociado con una resolución más alta, tiene advertencias, tales como reducción de la actividad enzimática en las proteínas separadas 8 y la formación de aductos molécula de Coomassie, siendo este último muy perjudicial para MS aguas abajo análisis 9. Ambos métodos, sin embargo, están asociados tradicionalmente con baja recuperación y la cobertura proteoma estrecha debido a las manchas y las limitaciones de extracción de gel 7.
Para el estudio de las proteínas desnaturalizadas, hay varias técnicas que mantienen la solubilidad macromolécula en el desempeño de alta resolución de fraccionamiento con alta recuperación de proteínas y que son compatibles con diVerse técnicas de análisis de proteínas después de la separación. Gel-eluido fracción líquida atrapamiento de electroforesis (GELFrEE) es una de las técnicas de fraccionamiento que se ajustan a todas estas características. Este método se aplica en gran medida en los estudios de alto rendimiento proteómica de arriba hacia abajo, lo que indica que es rápido y versátil. En GELFrEE, las proteínas se desnaturalizan y se separó basan en el peso molecular a través de una matriz de gel tubular, la porosidad de los cuales se puede variar basado en los requisitos de la muestra y los resultados de fraccionamiento deseados. Las fracciones que se eluyen en fase líquida, reduciendo así las limitaciones de recuperación asociados con SDS-PAGE, mientras que se mantiene una alta resolución. Alícuotas de fracciones pueden ser analizados por PAGE 1-D para la selección de ancho de banda de peso molecular 11. Hay una gran demanda de las ventajas asociadas a GELFrEE en técnicas de separación nativas. El método descrito en este documento, Claro nativo GELFrEE (CN-GELFrEE), es una adaptación natural de GELFrEE. Con el fin de ser compatible con una amplia spectrum de macromoléculas en su estado nativo, este método se basa no sólo en la química CN-PAGE suave, pero también en una separación en gradiente de porosidad, lo que reduce la precipitación de proteínas mediante la eliminación de la dura transición entre porosidades presentes en los sistemas de gel discontinuos 9. Cuando se aplica a fraccionar complejos de proteínas extraídas de corazón de ratón, fracciones eluidas muestran alta recuperación y una separación de alta resolución de una amplia gama de pesos moleculares se obtuvo. Además, las fracciones resultantes son compatibles con la mayoría de los análisis de proteínas bioquímicas y biofísicas de aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE se deriva del sistema de tampón PAGE nativa claro (CN) que usa una mezcla de detergentes aniónicos y neutros como moléculas portadoras 9 para el fraccionamiento de proteínas basado en el peso molecular a través de una matriz de gel. La aplicación de CN-GELFrEE a un extracto de proteína de corazón de ratón nativo generado fracciones de baja complejidad con anchos de banda discretos, mientras que el mantenimiento de las interacciones no covalentes de los ensamblajes biomoleculares. Comparaci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El WM Keck Foundation proporcionó generosamente fondos para este trabajo. Este material está basado en trabajo apoyado por una beca de investigación FAPERJ 100.039 / 2014 del gobierno de Río de Janeiro Estado – Brasil por RDM, Ciencia sin Fronteras beca 88888.075416 / 2013-00 de la Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior, bajo el gobierno de Brasil, para el FSS, la Fundación de Ciencias de becas de Postgrado Nacional de investigación con el número 2014171659 beca para OSS, y por una beca de investigación CNPq 202011 / 2012-7 por parte del gobierno de Brasil por LHFDVPCH es un receptor de Química de la vida de una Universidad Northwestern Procesos Instituto Postdoctoral Beca.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
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