CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez
Summary
This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.
Abstract
Protein kompleksleri önemli hücresel fonksiyonların bir dizi yerine getirir. onların kovalent olmayan etkileşimleri ve dinamikleri açıklık biyolojik sistemlerde komplekslerinin rolünün anlaşılması için her şeyden önemlidir. biyomoleküler meclislerinin doğrudan karakterizasyonu son yıllarda giderek daha önemli hale gelmiştir iken, kütle spektrometresi dahil mansap analiz teknikleri ile uyumlu doğal fraksiyon teknikleri, daha bu çalışmaları genişletmek için gereklidir. Bununla birlikte, saha doğal protein tertibatları için yüksek verimli, geniş aralıklı, yüksek geri kazanım ayırma yöntemi yoktur. Burada, kovalent olmayan protein meclislerinin için yeni bir ayırma yöntemidir net yerli jel-akıtılan sıvı kısmı tuzak elektroforezi (CN-GELFrEE) sunduk. CN-GELFrEE ayırma performansı fare kalp çıkarılan bölme kompleksleri ile gösterilmiştir. Fraksiyonlar 2 saat boyunca toplandı ve ~ 30 ila 500 kDa arasında değişen farklı bantlar sergilendi. bir conmoleküler ağırlık bant genişliği artırma tutarlıdır desen, her kadar ~ 100 kDa gözlenmiştir. Bundan başka, SDS-PAGE aracılığıyla yerel kısımların daha sonraki bir analiz tekrarı molekül ağırlıklı protein komplekslerinin denatürasyonu ile tutarlı değişimleri göstermiştir. Bu nedenle, CN-GELFrEE aşağı protein analizleri ile uyumlu kesirler sağlayan, büyük bir molekül ağırlığı aralığından protein kompleksleri üzerinde yüksek çözünürlüklü ve yüksek geri kazanım yerli ayrımları gerçekleştirme olanağı sunmak için kanıtlanmıştır.
Introduction
Bir hücre içinde meydana biyolojik işlemlerin büyük kısmı, bir protein düzenekleri yerine tek protein 1 ile gerçekleştirilebilir düşünülmektedir. Sonuç olarak, bir hücrede bir protein alt-birimi belirli bir biyolojik rolünü açıklamak amacıyla kompleksleri 2 başka proteinler veya ligandlarla yapısal etkileşimleri anlamak gerekmektedir. Ancak, onların kovalent olmayan etkileşimleri ve aktivitesini muhafaza, doğal proteinler okuyan, zorlu kalır. doğal protein çalışmaları eksiklikleri biri, çeşitli alt proteini analiz teknikleri ile uyumlu olan, uygun bir ana ayırma tekniğidir. Bu nedenle, biyomoleküllerin kovalent olmayan derlemeler karakterize edebilen ayırma teknikleri son faiz keskin 3 artmıştır.
Protein ayırma teknikleri biyokimya, biyofizik ve diğer çeşitli çalışmalara zorunludur. Güncel yerli ayırma teknikleri intrinsi varBöyle düşük çözünürlük, düşük verim, yağış kaybı ve ilk numunenin büyük miktarlarda gereği olarak aşağı analizler, uyumluluk azaltmak c eksiklikleri. Tandem afinite saflaştırma yaygın protein etkileşim çalışmaları için kullanılır, fakat yüksek verimli analizi 4 ile uyumlu olmasını neden her bir protein hedefi için ayn olarak da vardır. Boyut dışlama kromatografisi 5, tüm yerli ayırımları sağlanan, ancak doğal olarak düşük çözünürlüklü teknikleri ve yüksek ilk numune miktarlarda ihtiyaç var iyon afinite kromatografisi 5 ve yoğunluk-gradyan ayrımı 6 seçmeli çöktürme.
Seçenek olarak ise, bu mavi yerel (BN) ve Clear yerel (CN) PAGE gibi jel bazlı teknikler (ya 1-B ya da 2-D), yüksek çözünürlüklü ayırma gösterir. Ayrıca, diğer teknikler söz ile zıt, hem yerli SAYFA ayrımları geniş bir r çözünürlüğünü ve yerli yapısını korumakhidrofobik proteinler de dahil olmak üzere makromolekül türlerin ange. Bu özellik ayrıca bu yöntemlerin 7,8 ulaştığı proteom kapsamı genişletilmektedir ve CN ve BN-PAGE arasında farklı kimya ile elde edilir. CN-PAGE yaygın BN-PAGE Coomassie Mavi boya yerine taşıyıcı moleküllerin gibi yumuşak yüklü deterjanlar, dayanır. Daha yüksek çözünürlüğe ile ilişkili olmasına rağmen BN-PAGE, bu tür ayrılmış proteinlerin 8 ve Coomassie molekülü yaklaşımlı oluşumunda azalma enzimatik aktivite, ikincisi aşağı MS büyük ölçüde zarar olmak 9 analizler olarak uyarılar vardır. Her iki yöntem, bununla birlikte, geleneksel olarak, boyama ve jel özütleme sınırlamaları 7'ye düşük verime ve dar proteom kapsamı ile ilişkilidir.
denatüre proteinlerin çalışma için, orada yüksek protein geri kazanımı ile yüksek çözünürlüklü parçalaması yaparken makromolekül çözünürlüğü korumak çeşitli teknikler olduğunu ve d ile uyumludurayrılık sonrası protein analiz teknikleri alemin. Gel-Seyreltilmiş Sıvı Fraksiyon Tuzak Elektroforez (GELFrEE) tüm bu özelliklere uygun fraksiyonlara tekniklerden biridir. Bu yöntem büyük ölçüde hızlı ve çok yönlü olduğunu belirten, yüksek hacimli yukarıdan aşağıya proteomik çalışmalarında uygulanır. GELFrEE proteinler denatüre ve boru şeklinde bir jel matrisi ile molekül ağırlığına göre birbirinden ayrılarak, gözenekliliği Örnek şartları ve arzu edilen fraksiyon sonuçlara göre değiştirilebilir. Fraksiyonlar böylece yüksek çözünürlükte korurken, SDS-PAGE ile bağlantılı geri kazanım sınırlamaları indirgeme sıvı fazda elüte edilir. Fraksiyon alikuot'u daha sonra molekül ağırlıklı bant genişliği seçimi 11 1-B PAGE ile analiz edilebilir. Yerel ayırma teknikleri GELFrEE ilişkili avantajları yüksek bir talep vardır. Burada açıklanan yöntem Clear Yerli GELFrEE (CN-GELFrEE), GELFrEE bir yerli uyarlamasıdır. için bir geniş s ile uyumlu olacak şekildekendi doğal yapısında makromoleküllerin pectrum, bu yöntem, yumuşak CN-PAGE kimya, hem de süreksiz jel sistemleri 9 mevcut gözenek arasındaki sert geçiş ortadan protein çökelmesine azaltan bir gözeneklilik değişim derecesine ayrılması üzerine sadece dayanmaktadır. Fare kalp ekstre protein kompleksleri fraksiyonlanması uygulandığında, elüt fraksiyonlar yüksek bir geri kazanım ve elde edilen molekül ağırlıkları çok geniş bir aralık bir yüksek çözünürlüklü ayırma gösterilir. Bundan başka, elde edilen fraksiyonlar alt biyokimyasal ve biyofiziksel proteini analizleri çok uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
CN-GELFrEE jel matrisi ile molekül ağırlıklı bazlı protein paya ayırma için taşıyıcı moleküllere 9 gibi anyonik ve nötral deterjanların bir karışımını kullanan net yerli (CN) PAGE tamponu sistemi elde edilir. yerel bir fare kalp protein özü CN-GELFrEE uygulanması biyomoleküler düzeneklerinin kovalent olmayan etkileşimleri korurken farklı bant genişlikleri ile birlikte düşük karmaşıklık kısımlar oluşturdu. CN-PAGE ve SDS-PAGE jellerinin levha arasındaki kısımların karş…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM Keck Vakfı cömertçe bu iş için fon sağladı. hükümet altında, Yükseköğretim Personel İyileştirme Koordinasyon gelen Sınırlar burs 88888.075416 / 2013-00 olmadan RDM için Brezilya, Fen – Bu madde Rio de Janeiro Devlet hükümetten FAPERJ araştırma bursu 100,039 / 2014 tarafından desteklenen çalışma dayanmaktadır Brezilya, HSS için, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma OSS için burs numarası 2014171659 altında Kardeşliği ve CNPq araştırma bursu LHFDVPCH için Brezilya hükümetinden 202011 / 2012-7 tarafından Hayat bir Northwestern Üniversitesi Kimya alıcı Enstitüsü Postdoktora Süreçleri olduğunu Kardeşlik Ödülü.
Materials
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 15 mL conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a | |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
